microRNA-5692b在新疆哈薩克族食管癌中的表達及臨床意義

microRNA-5692b在新疆哈薩克族食管癌中的表達及臨床意義

卿松, 陳述, 李新霞

(新疆醫科大學第一附屬醫院病理科， 烏魯木齊830054)

摘要：目的探討microRNA-5692b(miR-5692b)在新疆哈薩克族食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中的表達情況及其與食管鱗癌臨床病理的關系。方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法(real-time quantitative PCR，RT-qPCR) 檢測microRNA-5692b在28例癌組織中和癌旁正常組織中的表達量，通過公式計算相對表達量，并分析表達量與臨床病理特征的關系。結果microRNA-5692b在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中及癌旁正常組織中的表達量差異有統計學意義(P<0.05)，在癌組織中呈高表達，并且隨著臨床分期的增高而升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。microRNA-5692b的表達與其他臨床病理特征無關(P>0.05)。結論microRNA-5692b在哈薩克族食管鱗癌組織中呈高表達，可輔助臨床食管鱗癌的診斷。

關鍵詞：microRNA-5692b; 哈薩克族; 食管鱗癌; RT-qPCR

中圖分類號：R365文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.007

[收稿日期：2015-03-04]

基金項目：國家自然科學

作者簡介：努爾比耶·努爾麥麥提(1989-)，女(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向：肥胖與代謝綜合癥。

基金項目：國家自然科學基金(81460502)

作者簡介：陳艷(1970-)，女，博士，教授，研究方向：環境毒理學, E-mail：ychen88@sina.com。

The expression of microRNA-5692b in Xinjiang Kazak′s esophageal

cancer and its clinical significance

QING Song, CHEN Shu, LI Xinxia

(DepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression of microRNA-5692b(miR-5692b) in Xinjiang Kazakh′s esophageal squamous cell carcinoma ( ESCC) tissue and to analyze the relationship between its expression with clinical pathological features. MethodsThe real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was adopted to detect the expression of microRNA-5692b in cancer tissues and adjacent normal tissues in 28 cases of squamous cell carcinoma and formulas were used to calculate the relative expression and to analyze the relationships between the expression in different groups and their clinical pathological features. ResultsThe expressions of microRNA-5692b were of significance (P<0.05) in Kazakh′s esophageal squamous cell carcinoma tissues and in adjacent normal tissues. It was in high expression in cancer tissues and increased with the clinical stage increasing, with statistical significance (P<0.05). The expression had nothing to do with other clinical pathological features (P>0.05). ConclusionThe expression of microRNA-5692b was high in Kazakh′s esophageal squamous cell carcinoma and it was proved helpful to diagnose the esophageal squamous cell carcinoma.

Key words: microRNA-5692b; Kazakh; esophageal squamous cell carcinoma; RT-qPCR

食管癌(esophageal carcinoma，Eca)是全球8種最常見腫瘤之一，其死亡率排名第6位[1]，發展中國家是其高發地域[2]。全世界每年約有48萬新發病例，食管癌包括食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC，簡稱鱗癌)和腺癌(adenocarcinoma，ADC)[3]。中國是食管癌高發區，每年全球50%的食管癌發生在中國，而其中約90%是ESCC[1]。新疆哈薩克族食管癌的死亡率(68.95/10萬)遠高于全國平均水平(14.95/10萬)和同地區的其他民族(22.3/10萬)[2]，嚴重危害著哈薩克族人民的健康。端木忠等[4]研究顯示環境及遺傳因素在食管癌發生、發展中起著重要的作用，如亞硝胺、生活飲食習慣等。非蛋白質編碼微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為17~25個堿基對構成的非編碼小分子單鏈RNA，其與細胞的分化、增殖、凋亡和轉移有密切關系[5]。本課題組前期實驗中通過基因芯片篩查發現microRNA-5692b在新疆哈薩克族食管鱗癌中呈高表達。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法( real-time quantitative PCR，RT-qPCR)進一步驗證并分析其在食管鱗癌中的表達情況，探討其在食管鱗癌發生、發展中的所起作用。

1材料與方法

1.1一般資料收集新疆醫科大學一附院病理科2009年1月-2014年7月28例哈薩克族食管鱗癌手術切除標本的存檔病理切片、蠟塊及臨床資料。所有病例均采用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，常規切片，HE染色。其中男性22例，女性6例，年齡38~69歲，中位年齡(54.50±7.90)歲，平均年齡(55.00±7.90)歲。10例有吸煙史(>5支/d)，7例有飲酒史(>2次/w)，隨訪至2014年12月，健在11例，死亡7例，失訪10例。腫瘤直徑1.8~7.5 cm。食管癌TNM分期、腫瘤分級均參照國際抗癌聯盟( international union against cancer，UICC) 的標準：高分化鱗癌8例，中分化鱗癌15例，低分化鱗狀癌5例。腫瘤僅浸潤至黏膜下層(T1)2例，浸潤至固有肌層(T2)12例，浸潤至纖維膜(T3)14例，淋巴結轉移5例。臨床分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期10例，Ⅲ期5例。每例鱗癌均取距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁正常組織作為對照。

1.2實驗試劑RNA提取試劑盒：miRNeasy FFPE kit(Qiagen)，逆轉錄試劑盒：RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒(Thermo Scientific)和 RT-qPCR試劑盒 Maxima SYBR Green/ROX qPCR預混液(2×)(Thermo)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成(表1)。

表1　逆轉錄及RT-qPCR所用引物序列表

1.3提取總RNA按照miRNeasy FFPE kit試劑盒操作步驟從石蠟切片中通過離心、去上清、加液、孵育、收集管過濾，獲取總RNA。使用NanoDrop-2000測定波長260/280 nm處的吸光度(A)值，確定總RNA的純度和濃度。

1.4逆轉錄用RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒和microRNA-5692b基因特異引物進行cDNA合成。逆轉錄體系包括4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL RiboLockTMRNA酶抑制劑(20 U/μL)、2 μL 10 mM dNTP Mix、1 μL RevertAidTM M-MuLV 逆轉錄酶(200 U/μL)、1 μL microRNA-5692b基因特異引物、9 μL無核酸酶的高純水, 再加入2 μL(150 ng/μL)RNA模板，共20 μL反應體系。按照試劑盒所給出條件進行逆轉錄：25℃，孵育5 min，42℃孵育60 min，70℃加熱5 min終止反應。逆轉錄產物cDNA存放于-70℃備用。

1.5實時熒光定量RT-PCRRT-qPCR的PCR擴增及溶解曲線分析均使用 ABI 7500PCR儀(Applied Biosystems)。以U6作為內參照進行反應，反應體系為25 μL，其中12.5 μL Maxima SYBR Green/ROX qPCR預混液(2×),上游引物 1 μL,下游引物 1 μL，cDNA 2 μL，無核酸酶的 8.5 μL。按給出的條件進行反應：初始變性，95℃反應10 min；變性，95℃反應15 s；退火，60℃反應30 s；延伸,72℃反應30 s，以上3個步驟進行40個循環。

1.6結果數據分析以U6為內參，采用相對定量法，通過Ct值及公式F=2-△Ct，計算microRNA-5692b在癌和癌旁正常組織中的表達量，△Ct=(待測樣品目的基因的Ct平均值-待測樣本內參基因的Ct平均值)，而microRNA-5692b在癌中表達量相對于癌旁正常組織表達量(Relative Quantity,RQ)的倍數關系用公式F=2-△△Ct(△△Ct=△Ct(鱗癌組織)-△Ct(癌旁正常組織))計算，若RQ≥1,說明microRNA-5692b在癌中的表達要高于癌旁正常組織；若RQ<1，說明microRNA-5692b在癌中的表達要低于癌旁正常組織。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理，各組間microRNA-5692b表達量的差異采用獨立樣本t檢驗分析，單因素生存分析采用乘積極限法(Kaplan-Meier),microRNA-5692b表達量(RQ)與預后關系采用線性回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1microRNA-5692b在食管鱗癌和癌旁正常組織中的表達microRNA-5692b在新疆哈薩克族食管鱗癌中及癌旁正常組織中均有表達，在癌組織中的表達量為(20.766±45.176)，癌旁正常組織的表達量為(1.343±1.971)，microRNA-5692b在癌組織中的表達量明顯高于在癌旁正常組織的表達量，差異具有統計學意義(P=0.031)。28例新疆哈薩克族食管鱗癌中，相對于正常組織中microRNA-5692b的表達，癌組織中microRNA-5692b表達量最高上調了280倍，最低下調了0.09倍。

2.2microRNA-5692b的表達與臨床病理特征的關系microRNA-5692b的高表達與臨床分期相關，隨著分期的增高，表達亦呈上升趨勢，差異具有統計學意義(P=0.032)。而與患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤病理分級、浸潤深度、腫瘤大小及有無淋巴結轉移均無關(P>0.05)(表2)。

2.3microRNA-5692b的表達與患者預后的關系通過Kaplan-Meier法比較高表達組(n=20)和低表達組(n=8)患者的生存期，發現高表達及低表達組生存時間差異無統計學意義(χ2=0.287,P=0.592)，見圖1。

圖1　microRNA-5692b相對表達量(RQ)與患者生存曲線

2.4microRNA-5692b的表達與患者預后相關性分析繪制28例哈薩克族食管鱗癌患者標本中microRNA-5692b相對表達量(RQ)與生存時間的散點圖，兩者間沒有明顯線性相關(r2=0.032，P=0.365>0.05)(圖2)，同時將低表達組(r2=0.002，P=0.907>0.05)(圖3)及高表達組(r2=0.111，P=0.177>0.05)(圖4)分別與生存時間制圖，也均未發現明確線性相關。

臨床病理特征例數表達量t值P值年齡/歲 ≥551414.125±40.161-0.7720.447 <551427.407±50.307性別 男2218.931±41.416-0.4050.689 女627.493±61.216腫瘤分化程度 高分化814.246±35.193-0.4760.638 中低分化2023.374±49.181浸潤深度 T1-T21412.571±40.310-0.9580.347 T31428.961±49.691淋巴結轉移 N02312.166±32.600-1.4170.224 N1-N2560.328±74.490臨床分期 Ⅰ121.829±3.183-2.3770.032 Ⅱ-Ⅲ1637.178±57.495腫瘤最大徑/cm ≥3.51825.673±51.4450.7650.451 <3.51011.933±31.440吸煙史 有1019.544±47.0710.1050.917 無1821.445±45.464飲酒史 有719.907±47.0220.0570.955 無2121.052±45.732

圖2　microRNA-5692b相對表達量與患者預后線性回歸分析

圖3　microRNA-5692b相對低表達量與患者預后線性回歸分析

圖4　microRNA-5692b相對高表達量與患者預后線性回歸分析

3討論

食管鱗癌是新疆哈薩克族高發腫瘤，形成原因復雜，常規治療效果不佳，從基因水平上尋找一種特異的標記物作為早期診斷的指標成為近幾年研究的熱點[6]，隨著microRNA的發現，使之成為可能。自在秀麗隱桿線蟲中發現第1個microRNA開始[7]，到目前為止已經報道的人類microRNA的數量超過21 000個[8]。microRNA是一類保守的單鏈非編碼RNA，其主要通過與靶基因microRNA 3′-UTR完全或不完全配對，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，在轉錄后水平調控人類近1/3的蛋白編碼基因，進而影響蛋白表達[9]。有研究表明microRNA在許多腫瘤組織中表現為“致癌”上調和“抑癌”的下調，這些異常表達的microRNA在惡性腫瘤的發生、發展等方面均起不同程度的重要作用[10]。

目前對microRNA的研究越來越多，其在腫瘤的作用也不盡相同，如Rani等[11]與劉尚國等[12]發現microRNA-939在腫瘤患者血清或腫瘤組織內呈高表達，有促進腫瘤生長的作用。而Acunzo等[13]發現microRNA-27a在肺癌中能夠通過調節肝細胞生長因子受體(MET)和表皮生長因子受體(EGRF)的表達，輔助肺癌的治療。

本研究采用RT-qPCR檢測microRNA-5692b在28例新疆哈薩克族食管鱗癌中的表達，發現microRNA-5692b在癌組織和癌旁正常組織中的表達量差異有統計學意義，microRNA-5692b在癌組織中呈高表達。但microRNA-5692b并非在28例哈薩克族食管鱗癌中均呈高表達，相對于癌旁正常組織，有8例的表達是下調的，與王江峰等[14]研究的MicroRNA-29b在食管鱗癌中的表達結果相似。本研究中microRNA-5692b的相對表達量總體趨勢是上調的，最高上調了280倍，平均上調33倍，與路軍[15]與Liu等[16]研究的部分microRNA表達結果相似，但是升高的程度要比后兩者更加明顯。microRNA-5692b基因在腫瘤組織中的表達上調，提示其在食管正常鱗狀上皮中可能處于非活化狀態，但隨著腫瘤的發生、發展而被激活，表達量增加。本研究同時證實microRNA-5692b在癌組織中的表達量的升高與腫瘤的臨床分期相關，即隨著臨床分期的升高，在癌組織中的表達量也不斷升高，提示microRNA-5692b可能在腫瘤的發展過程中起著促進作用，可能通過負調控腫瘤抑癌基因和/或控制細胞的分化或調亡途徑來促進腫瘤的發展。但鑒于microRNA-5692b相關報道及研究資料少見，其具體的作用機制有待于進一步研究。

本研究中，microRNA-5692b雖在腫瘤中呈高表達，但其相對高表達組和低表達組生存時間的差異無統計學意義，不過從曲線的走勢可以看出，高表達組的生存時間總體上要低于低表達組，提示microRNA-5692b的高表達可能預示患者預后不佳。

有研究報道，microRNA的表達量往往與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及預后具有相關性[17-19,12]。但本研究中，microRNA-5692b的表達量與腫瘤浸潤深度、腫瘤大小、淋巴結轉移、預后無相關性，也與年齡、性別、部分生活習性無相關性，出現這樣的結果，可能也與觀察對象的數量及相關臨床信息缺失有關。

綜上所述，microRNA-5692b在新疆哈薩克族食管鱗癌中呈高表達，并隨臨床分期增高而升高，在食管鱗癌的診斷中有輔助作用。但microRNA-5692b的高表達是否可以作為新疆哈薩克族食管鱗癌的早期診斷指標，需待擴大觀察對象并增加種族對比后進一步證實。

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(本文編輯楊晨晨)

通信作者：關亞群，女，教授，博士生導師，研究方向：肥胖與代謝綜合癥， E-mail:yaqunguan@163.com。

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