腎透明細胞癌患者血清中miR-21的表達及其臨床意義

腎透明細胞癌患者血清中miR-21的表達及其臨床意義

管金， 哈木拉提·吐送， 王文光， 拜合提亞·阿扎提， 木拉提·熱夏提， 安恒慶， 王玉杰

(新疆醫科大學第一附屬醫院泌尿中心， 烏魯木齊830054)

摘要:目的探討腎癌患者與健康人血清中miR-21的表達差異及其切除腫瘤組織后血清中的表達變化，為后期深入性研究奠定理論基礎。 方法收集新疆醫科大學第一附屬醫院泌尿外科新診斷腎癌患者30例術前血清樣本(cRCC組)，并于術后1個月收集其血清，另選擇30例健康志愿者血清作為對照組，采用實時熒光定量PCR技術檢測cRCC組術前、術后和對照組血清中miR-21的表達。結果cRCC組術前、術后及對照組血清中miR-21的表達水平差異有統計學意義(Kruskal-wallis H秩和檢驗,H≈χ2，P=0.001)，cRCC組術前血清中miR-21表達水平是對照組的12.99倍(Z=-3.252，P=0.001),術后的表達水平是對照組的1.03倍(Z=-0.103，P=0.918)，cRCC組術后血清中miR-21表達水平較術前明顯下降(Z=-3.349，P=0.001)。 結論腎癌患者血清中miR-21明顯高表達，在切除腫瘤組織后其表達水平明顯下降，提示其與腎腫瘤密切相關，是腎癌潛在分子標記物。

關鍵詞：血清microRNAs； 腎癌； miR-21； 分子標記物

中圖分類號：R737.11文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.05.005

[收稿日期：2015-02-28]

The changes of expression levels of miR-21 in the serum of patients

with renal cell carcinoma

GUAN Jin， Hamulati Tusong， WANG Wenguang， Baihetiya Azhati， Mulati Rexiat，

AN Hengqing， WANG Yujie

(DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression levels of miR-21 in the serum of patients with renal cell carcinoma, and to lay a theoretical foundation for the in-depth study in the future. Methods30 serum samples of patients with renal cell carcinoma was collected before surgery, and the blood serum samples were collected again after surgery a month later. Moreover, the study includes 30 healthy controls. The expression levels of miR-21 in the serum of samples from three groups were compared by using the real-time PCR. ResultsmiR-21 expression in serum have statistical significance amang renal clear cell carcinoma, post-operation and normal group (Kruskal-wallis H rank sum test H, H≈χ2=14.882, P=0.001). compared with the normal group, miR-21 expression in renal cell carcinoma is 12.99 times (Z=-3.252, P=0.001), and in post-operation is 1.03 times (Z=-0.103 P=0.918). ConclusionThe expression levels of miR-21 in the serum in patients with renal cell carcinoma is significantly increased, while it decreased significantly after resection. The outcome suggests that the expression levels of miR-21 in the serum is closely related with renal cell carcinoma. Therefore, miR-21 can be regarded as a potential molecular marker in renal cell carcinoma.

Key words: serum microRNAs; renal cell carcinoma; miR-21; molecular markers

對于腎細胞癌早期發現和早期治療至關重要，按照AJCC腎癌分期，其中Ⅰ期5年生存率約為98%，Ⅲ期5年生存率約為5%[1], 而腎癌早期常沒有任何癥狀,這使早期發現腎癌顯得非常困難，組織活檢或切片屬創傷性方法，在臨床上無法實現腫瘤的早期診斷和治療效果的正確評估。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一類全長約19~25 nt的非編碼單鏈小分子RNA，成熟的miRNA在RISC(RNA-induced silencing complex)引導下通過與mRNA的3′端非翻譯區(’-UTR)完全或不完全互補配對，從而影響靶mRNA的翻譯，引起翻譯后水平調節基因表達作用[2-3]。在腎腫瘤的生長和轉移中，miR-21可以通過抑制腫瘤的抑癌基因而發揮重要作用[4]。另據Mitchell等[5]報道，血清中特異的miRNAs與腫瘤組織中的表達水平具有一致性，并指出血清中特異的miRNAs來源于腫瘤組織。目前有關循環miR-21在腎癌方面的研究較少。本研究旨在探討miR-21在腎透明細胞癌患者血清中的表達情況，以及與腎腫瘤組織間的關系，為后期深入性研究提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年2月-2014年7月新疆醫科大學第一附屬醫院泌尿外科新診斷腎癌患者術前收集的30例血液樣本(cRCC組)，并于術后1個月收集其血液樣本。另外30例健康對照血清樣本(健康對照組)來自于本院體檢中心。所有腎癌患者均有相應的病理檢查。cRCC組中男性22例，女性8例，平均年齡(52±11)歲；健康對照組男性21例，女性9例，平均年齡(47±9)歲。該研究獲得新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的批準，所有研究對象在收集血液前均簽署知情同意書。

1.2血液樣本處理血液樣本均在收集后5 h內處理：4℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，保存于-80℃待用。

1.3方法

1.3.1血清中總RNA的提取按mirVanaTMPARISTMKit(Ambion,USA)試劑盒說明書操作步驟提取血清中的總RNA。實驗步驟如下：用300 μL的血清加入等體積的變性液，混均后加入試劑盒提供的acidic phenol:chloroform，充分混勻后離心，收集上清液，在收集的上清液中加入無水乙醇，經過幾次洗脫和離心后，最后用預熱到95℃的洗脫液60 μL洗脫RNA，最后收集包含RNA的洗脫液，RNA液保存于-80℃待用。對提取的RNA純度和濃度的測定通過分光光度計Nanodrop ND-1000(Thermo scientific)檢測，A260/A280=1.9~2.1則其提取的純度較滿意。

1.3.2反轉錄針對每一種miRNA，ABI公司均設計了1個含相同莖環結構的基因特異性反向引物，利用miRNA特異性反向引物進行逆轉錄，就可以得到含共同莖環結構但屬于特定miRNA的cDNA。通過帶有stem-loop結構的特殊引物來進行逆轉錄成c DNA ,特異性反轉錄引物均由上海生工合成，miR-21反轉錄引物序列為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA-

TACGACTCAACA-3′，上游引物序列：5′-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′，下游引物序列：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,內參U6反轉錄引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo scientific)試劑盒合成c DNA,根據說明書分別加入總RNA,特異性引物、緩沖液、RNA酶抑制劑等，最后混合成總體積為20 μL進行RT-PCR反應。反應條件設置：42℃ 60 min ， 70℃ 5 min，最后保持在4℃。合成的c DNA ，保存于-20℃或更低溫度。

1.3.3實時熒光定量PCR采用Maxima SYBR Green q PCR Kit(Thermo scientific)試劑盒進行定量,按廠家說明書分別加入2 μL cDNA、10 μL Maxima SYBR Green q PCR Master Mix (2x)、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、無RNA酶水，最后混合成總體積為20 μL進行反應。使用7500 Real-time PCR儀(Biosystems)進行定量PCR,反應條件設置：95℃孵化3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，進行40個循環。每個樣本每種miRNA均重復2次，最后取其平均值，并使用陰控對照。用SDS1.4軟件(Biosystems)計算每個樣本的CT值(反應最初，雖然產物是指數增長，但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加，當累積了足夠的擴增產物，產生可檢測的熒光信號時，這個循環數為初始循環數，即CT)，CT值主要由擴增反應體系中模板的初始濃度決定。

1.3.4數據分析進行相對基因表達分析采用等式2-△△CT法，條件是目標基因和內參基因的擴增效率都接近100%且相互間的效率偏差在5%以內，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組；△CT實驗組=CT目標基因，實驗組-CT內參基因，實驗組；△CT對照組=CT目標基因，對照組-CT內參基因，對照組，2-△△CT表示實驗組相對于對照組目的基因的表達倍數。選用U6作為內參基因[6]，對目的基因進行歸一化處理。

1.4統計學處理先對數據進行正態性和方差齊性檢驗，不服從正態性分布使用Kruskal-wallis H檢驗來比較3組間的差異，兩組間比較使用Mann-Whitney U秩和檢驗，根據數據特征，選用合適的統計學分析方法，所有的數據均通過SPSS17.0 軟件進行統計學處理，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

本研究數據不符合正態分布，數據結果均以中位數表示。本研究結果表明，cRCC組術前、術后與健康對照組血清中miR-21表達水平差異有統計學意義(Kruskal-wallis H秩和檢驗,H≈χ2，P=0.001)；隨后兩組間進行比較 , cRCC組術前血清中miR-21表達水平是對照組的12.99倍，差異有統計學意義( Z=-3.252, P=0.001)； cRCC組術后表達水平是對照組的1.03倍，差異無統計學意義(Z=-0.103，P=0.918)；cRCC組術后血清中miR-21表達水平較術前明顯下降，差異有統計學意義(Z=-3.349，P=0.001)。通過對不同性別、年齡段、腫瘤直徑、Fruhman分期的表達差異進行檢驗，其表達差異均無統計學意義，即血清中miR-21的表達水平與性別、年齡、腫瘤直徑、Fruhman分期無關，結果見表1。

表1血清中miR-21的 表達水平與腎癌患者臨床病理資料的關系

cRCC例數中位數P值Fruhman分期 Ⅰ~Ⅱ1814.490.796 Ⅲ127.30腫瘤直徑/cm ≥41416.850.466 <41611.68

3討論

miRNA 是眾多小RNA中的一類。1993年，Lee等[7]在秀麗隱桿線蟲中發現第1個miRNA(lin-4)，當時并沒有引起重視，到2001年，這類小RNA分子在脊柱動物中被發現，才開始引起重視，并將這類小RNA分子命名為microRNA,至此，人們開始對miRNA有了一個新的認識。miRNA既可作為抑癌基因，也可以作為癌基因參與調控腫瘤的發生、發展過程[8]。Lewis等[9]研究發現miRNAs參與調控人類大約30%的mRNAs。張輝等[10]通過將miR-21的前體Pre-miR-21和抑制物anti-miR-21分別轉染腎癌Caki-1細胞，實時熒光定量PCR驗證轉染效果，pre-miR-21和anti-miR-21轉染后能分別升高和降低Caki-1細胞中miRNA-21的表達量，隨后觀察發現pre-miR-21組穿透濾膜的細胞數明顯增加，而anti-miR-21組穿透濾膜的細胞數明顯減少，證實miR-21與腎癌的侵襲轉移相關。另外有研究通過給小鼠注射染料木素處理過的腎細胞癌后，發現形成腫瘤明顯小于對照組，染料木素在體內外可以降低miR-21的表達，并發現miR-21的表達與腎細胞癌患者的總生存期呈負相關[4]。起源于腫瘤組織的特異循環miRNAs最初是由Mitchell 等[5]提出，隨后發現特異循環miRNAs可作為前列腺癌的潛在分子標記物,并通過實驗證實血漿中miRNAs穩定性較好，在室溫下及凍存后解凍并不導致其明顯降解，在腎腫瘤組織中miR-21高表達。本研究進一步研究了循環中的miR-21表達水平，結果顯示相對于健康對照明顯高表達。另外，miR-21在腎細胞癌中高表達，切除腫瘤組織1 w后，血清中其表達水平就開始下降[11]。本研究發現在切除腎腫瘤組織1個月后，血清中miR-21表達水平較術前明顯下降，并逐漸恢復正常水平，也提示其表達水平與腎腫瘤組織密切相關， miR-21可用于腫瘤術后復發、轉移的監測。

另外，近些年的研究發現miR- 34a在腎癌的發生、發展過程中起重要作用，并指出其可作為治療腎癌的潛在靶標，同時提出腎癌可能是基因疾病，涉及多個基因改變。Gan 等[12]發現miR-34a通過靶基因CD44而抑制腫瘤細胞的生長和轉移，可見miR-34a充當抑癌基因作用，而參與調節腫瘤的發生、發展， CD44為分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，主要參與異質性黏附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的黏附，異質性黏附在腫瘤細胞侵襲轉移中起促進作用。在腎細胞癌中，CD44高表達，在腎癌發病過程中起重要作用[13]， miRNAs本身和它們的調控對象都可作為藥物的靶點，為腫瘤防治提供新的思路， 對miR-21靶基因及其在腎腫瘤發生、發展中的作用機制深入研究有望為生物靶向治療提供新的靶點。

事實上，特異的miRNAs不僅在腎癌中表現為差異性表達，在其他腫瘤中也出現差異性表達，例如在結腸癌中，miR-29和miR-92a出現高表達[14]；在前列腺癌中，miR-26a呈現高表達[15]。Chen等[16]研究發現無論健康人或者患者血清中都存在大量的miRNA及部分的mRNA、r RNA和其他未分類小分子RNA，證實了血清中存在大量的miRNA。研究人員為了進一步觀察miRNA對外界條件的耐受性，研究內容包括了放置時間、溫度變化、pH值高低，結果發現血清中的miRNA在受到上述情況改變時沒有發生明顯變化[5,17]。Taylor等[18]發現不同性別及不同年齡段患者血清中的miRNAs沒有明顯差異性改變。本研究也比較了患者不同年齡段、性別間miR-21的表達差異，發現均無統計學差異，所以miR-21作為腫瘤標記物受干擾小，是可行的。

綜上所述，miR-21與腎細胞癌的發生、發展密切相關，是腎癌潛在分子標記物。

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(本文編輯張巧蓮)