NRP-1和NRP-2在結直腸癌組織中的表達水平及臨床意義*

周秋媛，王紅莉，李 虹，李 偉，徐艷華(恩施州中心醫院病理科，湖北恩施 445000)

結直腸癌為常見消化道惡性腫瘤之一，近年來有年輕化傾向，嚴重危害患者健康甚至危及生命[1，2]。結直腸癌的發病與多種因素有關[3]，其治療以手術治療為主，同時輔助放化療。早發現、早治療對結直腸癌病情的緩解具有重要意義[4]。近年來，腫瘤標志物在惡性腫瘤發病中的作用為越來越多學者重視。神經纖毛蛋白1(neuropilin,NRPs)家族中，NRP-1，NRP-2為其主要成員，參與了多種生物學反應。研究發現，NRP-1，NRP-2在非小細胞肺癌[5]和鼻咽癌[6]等惡性腫瘤細胞的增殖和淋巴結轉移中發揮重要作用，在這些惡性腫瘤中，NRP-1，NRP-2可出現異常表達。有關NRP-1，NRP-2的表達與結直腸癌發病關系的研究較少。因此，本研究通過檢測結直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2的表達水平，旨在探討NRP-1，NRP-2的表達與結直腸癌發病及臨床病理的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2014年12月～2015年9月期間被湖北省恩施州中心醫院收治的65例結直腸癌患者和65例腸息肉患者作為研究對象。結直腸癌和腸息肉均經病理科確診[7]。65例結直腸癌患者年齡41～80歲，平均年齡為65.37±7.81歲，病程3～7年，平均病程為3.26±0.74年，均無吸煙史、飲酒史，其中2例有結直腸癌家族史。腸息肉患者年齡41～80歲，平均年齡為64.81±7.16歲，病程3～5年，平均病程為2.97±0.67年，均無吸煙史、飲酒史、結直腸癌家族史。選擇同期在我院健康檢查的65例健康女性作為正常對照組，年齡41～80歲，平均年齡65.14±7.36歲，均無吸煙史、飲酒史、結直腸癌家族史。3組年齡、吸煙史、飲酒史、結直腸癌家族史等資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，有可比性。本研究經入組對象簽署知情同意書，并獲湖北省恩施州中心醫院倫理委員會審批通過。

1.2 試劑和儀器 用真空干燥管抽取入組對象空腹靜脈血4 ml，其中42例接受結直腸癌改良根治術的病例在其治療后再次抽取空腹靜脈血4 ml；上述標本用美國Invitrogen公司生產的離心機，以3 500 r/min離心10 min后取上清液保存備用。

1.3 方法 采用美國Invitrogen公司生產的熒光定量PCR儀行RT-PCR，檢測結直腸癌和腸息肉及健康人群血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的表達水平，以GAPDH為內參。NRP-1上游引物為：5’ GCGTGAGTGTGTGTGTGTGAGTG 3’，下游引物為：5’AAGCTCTGGGTTTCATGCCA 3’；GAPDH上游引物為：5’AGAAACGAGCCTGCCTTACA 3’，下游引物為：5’ATCAAGTCCAGGGCTTCAGA 3’。NRP-2上游引物為：5’AAGAAGCATTTCAACGCCTCC 3’，下游引物為：5’TGGAATGGAGCAGCGGAGTC 3’；GAPDH上游引物為：5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC 3’，下游引物為：5’TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC’。PCR反應步驟如下：94℃預變性3 min：94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環，72℃延伸10 min。

1.4 統計學分析 使用SPSS 16.0軟件，計量資料執行單因素方差分析或t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組、腸息肉組、對照組血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平 經RT-PCR檢測，結直腸癌組NRP-1水平(36.51±4.62 μg/ml)高于腸息肉組(8.19±4.08 μg/ml)和健康對照組(7.92±4.05 μg/ml)，差異有統計學意義(F=50.32，P=0.000)；結直腸癌組NRP-2 mRNA水平(24.59±3.26 μg/ml)高于腸息肉組(5.47±1.11 μg/ml)和健康對照組(5.19±1.05 μg/ml)，差異有統計學意義(F=49.36，P=0.000)。腸息肉組和健康對照組NRP-1，NRP-2 mRNA水平比較，差異無統計學意義(t=1.07，1.15，P=0.762，0.789，>0.05)。

2.2 結直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的水平與臨床病理的關系 見表1。經RT-PCR檢測，隨著患者病理分期的增加、分化程度的降低，結直腸癌組血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈升高趨勢。此外，結直腸癌組血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平與患者是否伴肝轉移、出現淋巴結轉移有關。伴肝轉移和淋巴結轉移的結直腸癌患者，血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平高于未出現肝轉移和淋巴結轉移的結直腸癌患者(P<0.05)。結直腸癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平與年齡未表現出明顯的相關性(P>0.05)。

2.3 相關性分析 將結直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA等指標進行相關性分析，結果顯示，結直腸癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈正相關(r=0.415，P=0.015)。

3 討論

NRP-1，NRP-2為NRPs家族的成員，在多種生物學過程中扮演重要角色[8，9]。安吉洋等[10]發現，NRP-1在機體的神經損傷及修復過程中發揮重要作用。亦有學者[11]發現，NRP-1在非小細胞肺癌中出現異常表達，NRP-1的水平異常變化與非小細胞肺癌的發病及進展密切相關。孫瑾等[6]的體內外試驗研究顯示，抑制NRP-1的表達對抑制鼻咽癌細胞的增殖、促進鼻咽癌細胞的凋亡具有顯著作用。國外研究[11]發現，除了NRP-1，NRP-2在神經損傷、修復甚至腫瘤疾病的發病進展中亦扮演重色角色。

表1 結直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2 mRNA的水平與臨床病理的關系

有關NRP-1，NRP-2的表達水平與結直腸癌關系及其在結直腸癌的發病和病理變化中的作用的相關研究較少，因此本研究對此進行探討。本研究采用RT-PCR技術檢測了結直腸癌、腸息肉及健康者血清中NRP-1和NRP-2的水平，檢測結果顯示，結直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2呈高水平，明顯高于腸息肉及健康人群。這表明NRP-1和NRP-2的表達水平與結直腸癌的發病亦有關。與相關研究[11]結果一致。

此外，我們亦檢測了不同臨床病理結直腸癌患者血清中NRP-1，NRP-2的表達水平。經RT-PCR檢測，我們發現，NRP-1和NRP-2的表達水平與結直腸癌患者的年齡無明顯相關性，但NRP-1和NRP-2水平與結直腸癌患者的病理分期及分化程度明顯相關。結直腸癌患者出現肝轉移及淋巴結轉移預示著患者預后差，而我們在研究中發現，伴肝轉移和淋巴結轉移的患者其血中NRP-1和NRP-2水平高于未出現肝轉移和淋巴結轉移的患者。表明NRP-1，NRP-2的水平與結直腸癌患者的預后亦密切相關。而相關性顯示，結直腸癌患者血清NRP-1，NRP-2 mRNA水平呈正相關，這表明NRP-1，NRP-2在結直腸癌的發病及病理變化過程中可能共同發揮作用。

結合相關研究，我們推測，NRP-1，NRP-2可能通過下述途徑參與了結直腸癌的發病及病情進展：①NRP-1，NRP-2與VEGF家族有關成員相結合，促進惡性腫瘤細胞的增殖[12]；②NRP-1，NRP-2與配體SEMA家族成員相結合，促進結直腸癌腫瘤細胞的增殖及血管生成[13，14]；③NRP-1，NRP-2可以促進結直腸癌患者淋巴結的轉移和惡性腫瘤細胞的侵襲[15]。

本研究不足之處在于樣本量較少，因此對實驗結果可能會造成一定的影響。本研究結果顯示，結直腸癌血清NRP-1，NRP-2水平高于腸息肉及健康人群。血清NRP-1，NRP-2水平與結直腸癌的臨床病理及預后密切相關，NRP-1，NRP-2可能共同起作用。

[1] 鄒瞭南，吳畑華，刁德昌，等．三聯療法在結直腸癌合并梗阻治療中的應用[J]．中華胃腸外科雜志，2015，18(1)：77-79．

Zou LN，Wu TH，Diao DC，et al．Triple therapy in the application of the colorectal cancer complicated with obstruction[J]．Chinese Journal of Gastrointestinal Surgery，2015，18(1)：77-79．

[2] 張立達，白陽秋，楊玉秀．分泌性白細胞蛋白酶抑制劑在結腸癌中的作用[J]．中華實驗外科雜志，2015，32(7)：1695-1697．

Zhang LD，Bai YQ，Yang YX．Role of secretory leukocyte protease inhibitor expression in the tumorigenesis of colon cancer[J]．Chinese Journal of Experimental Surgery，2015，32(7)：1695-1697．

[3] Schmidt T，Strowitzki MJ，Reissfelder C，et al．Influence of age on resection of colorectal liver metastases[J]．J Surg Oncol，2015，111(6)：729-739．

[4] 陳曉露．白細胞介素4基因多態性與結直腸癌的易感性[J]．現代檢驗醫學雜志，2015，30(5)：105-106，110．

Chen XL．Interleukin-4 gene polymorphisms and colorectal cancer susceptibility[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2015，30(5)：105-106，110．

[5] 董娟聰，張海芹，高 輝，等．神經纖毛蛋白1對非小細胞肺癌放射敏感性的影響[J]．中華放射醫學與防護雜志，2014，34(11)：809-812．

Dong JC，Zhang HQ，Gao H，et al．Effect of neuropilin-1 on radio-sensitivity of non-small cell lung carcinoma[J]．Chinese Journal of Radiological Medicine and Protection，2014，34(11)：809-812．

[6] 孫 瑾，王 亮，婁衛華，等．shRNA沉默NRP-1基因抑制鼻咽癌CNE-2Z細胞生長的體內外研究[J]．中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2015，50(4)：312-317．

Sun J，Wang L，Lou WH，et al．NRP-1/shRNA silencing suppresses nasopharyngeal carcinoma cell growth in vitro and in vivo[J]．Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，2015，50(4)：312-317．

[7] 2014年NCCN結直腸癌臨床指南更新要點[J]．中國全科醫學，2014，17(30)：3539．

Updating points of 2014 NCCN colorectal cancer clinical guidelines[J]．Chinese General Practice，2014，17(30)：3539．

[8] Liu Y，He G，Wang Y，et al．MCM-2 is a therapeutic target of Trichostatin A in colon cancer cells[J]．Toxicol Lett，2013，221(1)：23-30．

[9] 王欽君，張紅春，申嫻娟，等．MicroRNAs作為結直腸癌潛在標記物的研究進展[J]．現代檢驗醫學雜志，2015，30(4)：107-110，114．

Wang QJ，Zhang HC，Shen XJ，et al．MicroRNAs as a potential marker in the progress of colorectal cancer[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2015，30(4)：107-110，114．

[10] 安吉洋，宋錦寧，王軍鋒，等．大鼠彌漫性軸索損傷后突起坍塌蛋白Sema3A及其受體neuropilin-1的表達[J]．西安交通大學學報(醫學版)，2014，35(6)：753-759．

An JY，Song JN，Wang JF，et al．Expressions of se-maphorin 3A and neuropilin-1 in the brain after diffuse axonal injury in rats[J]．Journal of Xi’an Jiaotong University(Medical Sciences)，2014，35(6)：753-759．

[11] McKenna CC，Munjaal RP，Lwigale PY．Distinct ro-les for neuropilin1 and neuropilin2 during mouse corneal innervation[J]．PLoS One，2012，7(5)：e37175．

[12] Maulik D，De A，Ragolia L，et al．Down-regulation of placental neuropilin-1 in fetal growth restriction[J]．Am J Obstet Gynecol，2016，214(2)：279．e1-9．

[13] Elahouel R，Blanc C，Carpentier G，et al．Pleiotrophin exerts its migration and invasion effect through the neuropilin-1 pathway[J]．Neoplasia，2015，17(8)：613-624．

[14] Pellet-Many C，Mehta V，Fields L，et al．Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury[J]．Cardiovasc Res，2015，108(2)：288-298．

[15] Groppa E，Brkic S，Bovo E，et al．VEGF dose regulates vascular stabilization through Semaphorin3A and the Neuropilin-1+ monocyte/TGF-β1 paracrine axis[J]．EMBO Mol Med，2015，7(10)：1366-1384．