呼吸道合胞病毒基因分型的研究進展*

梁有才，陸學東(.廣東醫學院，廣東湛江 54000；.廣東醫學院附屬福田醫院，廣東深圳 58033)

人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒嚴重呼吸道感染的主要病原體之一[1]。RSV的流行受地理位置、季節、氣候因素影響；在溫帶地區，無論南北半球，以冬春季節流行為主；靠近赤道地區常年流行[2]。RSV感染者一般是兩歲以內的嬰幼兒，或者是老年人與免疫缺陷者；隨著兒童年齡增長，感染概率降低。RSV所導致的癥狀包括呼吸道感染、發燒、中耳炎、哮喘、嚴重的細支氣管炎和肺炎等[3～6]。世界衛生組織在全球疫苗計劃中優先發展RSV疫苗，RSV融合蛋白是國外僅有的被批準用于預防高危嬰幼兒感染RSV的單克隆抗體，但在中國尚未被批準使用，中國還沒有預防RSV感染的有效疫苗[4]。

因此，研究準備更多RSV基因與疾病關系的資料，將在RSV感染的疫苗研制、診治和衛生保健方面發揮重要作用。本文擬對RSV的基因分型，及其與疾病的相關性做討論。

1 RSV的基因結構

呼吸道合胞病毒是一種有包膜的RNA病毒，屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，基因有15 222個核苷酸(nt)，共含有10個基因，其側翼序列有44nt的前導序列(leader)與155nt的拖尾區(trail)，順序為：3’-Leader-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-Trailer-5’，在L基因起始與M2基因結尾序列之間有68nt的重疊基因。除L基因外的其它基因都有保守的起始序列，這些基因包含有病毒復制轉錄的啟動子，L基因的起始序列為3’-CCCCGUUUA……5’，它包含了能讓病毒直接轉錄所需的啟動信息。10個基因能編碼至少11種已知蛋白：NS1和NS2為非結構蛋白，是干擾素系統的拮抗物；N是核殼蛋白；P是磷酸蛋白，是聚合酶復合物的重要成分；M是基質蛋白；SH是一種小疏水橫跨膜表面糖蛋白；G是一種N端和O端糖基化的Ⅱ型橫跨膜黏附糖蛋白；F是N端糖基化的Ⅰ型橫跨膜糖蛋白，與細胞質膜融合，在物質通過胞膜時產生作用；M2基因至少編碼了兩種產物(其中的M2-1是一種獨特的轉錄因子，而M2-2是一種調節因子)；L基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶的催化亞基。除了NS1，NS2和M2-2以外，所有的蛋白都是病毒顆粒的結構成分。G和F蛋白是主要的保護與中和抗原。N，F，M2-1和SH蛋白是細胞毒性T細胞的靶位[1]。

2 RSV的基因分型

目前RSV基因檢測相關技術有：各種PCR技術，包括巢式PCR，RT-PCR，實時熒光定量PCR等；還包括DNA測序、核酸雜交技術、基因芯片技術、多重基因表達遺傳分析系統(GeXP)等。分子生物學技術的發展使RSV基因檢測分型更加快捷準確，越來越多新的RSV基因型被發現與研究。

已經報道的RSV基因型包括RSV-A與RSV-B。RSV-A包括：SAA1，GA1，GA2… GA6，GA7，NA1，NA2，ON1，CB-A。RSV-B包括：URU1，URU2，GB1，GB2，GB3，GB4，SAB1，SAB2，SAB3，SAB4，BA1，BA 2… BA11，BA12，AB4，CB-B，GB5(CB1)[1，3～5，7～9]。

RSV的兩種主要的基因型A(RSV-A)和B(RSV-B)，分型依據為RSV的G蛋白與單克隆抗體反應的不同，以及G蛋白基因的不同(也有報道，RSV基因分型是基于單克隆抗體對G蛋白、F蛋白的反應，以及這兩種蛋白的基因分析[8]，更細的基因分型基于G蛋白基因C末端結尾第二高度可變區核苷酸序列分析[3，9]。G蛋白總體構架類似于黏蛋白，但缺少了其它副黏病毒黏附蛋白中所具有的血細胞凝集素和神經氨酸酶的活性[1]。G蛋白極易發生基因突變，典型的RSV-A和RSV-B之間，G蛋白氨基酸序列的50%可以改變，不同基因型間G蛋白氨基酸的同源性可僅有53%，抗原相關性可僅為5%[10]。

RSV-A和RSV-B各自的型內也存在主要源于G蛋白的抗原與基因的較大差異(可存在20%的氨基酸改變)，還有SH和N蛋白的有限變異。氨基酸序列的變異處于G蛋白的兩個胞外區，橫跨膜區與胞內中心富含半胱氨酸區則高度保守，但位于保守區旁邊的兩個區域是高度可變區。分析這兩個區域的變化提示有三個突變的機制：①替換；②三個可讀框移碼突變；③終止密碼子的改變，導致不同長度的蛋白的產生[1]。基因型內差異為進行更細基因分型提供了依據，也提供了型內進化的基礎。對RSV毒株進行種系遺傳學分析顯示，RSV-A基因進化率估計在6.72×10-4替代/位點/年(95%HPD：5.61×10-4，7.6×10-4)，而RSV-B的進化率估計在7.69×10-4替代/位點/年(95%HPD：6.81×10-4，8.62×10-4)[5]。

此外，有學者提出，不僅僅RSV的基因編碼序列可以變異，控制基因表達的信號也可以改變，所以調整關鍵蛋白的表達進而影響基因表達是導致抗原變異的第二個原因[1]。推測這可能已經影響到了之前的基因分型結果，或可能會成為基因分型的又一個依據。

3 RSV-A與RSV-B的感染優勢對比

RSV的兩種主要基因型RSV-A和RSV-B以各種混合形式傳播[4]，它的流行受地理位置和季節因素的影響，兩種主要基因型的交替流行可能跟人體免疫導致的選擇壓力有關[2，10]。

很多研究對比了RSV兩種主要基因型的疾病感染優勢：De-Pairs等[6]發現，南巴西的RSV-A占疾病感染優勢。Bose等[5]發現，烏拉圭蒙得維的亞地區通常RSV-A占疾病感染優勢，但某些感染中，RSV-B會更頻繁地被檢測到。Obodai等[11]發現，加納的RSV-B占疾病感染優勢。Biswas等[8]發現，東北印度阿薩姆邦地區2009～2012年間只檢測到RSV-A(NA1，GA5)感染，未能檢測到RSV-B。Choudhary等[4]總結發現，西印度2009～2012年RSV-B總體上占疾病感染優勢。但2009～2010年期間RSV-B占疾病感染優勢，2011年RSV-A占疾病感染優勢，在2012年RSV-A占疾病感染優勢。Geis等[12]發現，德國海德爾堡地區RSV-A占疾病感染優勢。杜麗娜等[10]發現，中國重慶地區2008～2009年度RSV-B占疾病感染優勢。Ren等[7]發現，中國重慶兒童醫院檢出的RSV-A總體上占疾病感染優勢。進一步分析發現，在2009年夏季到2010年的春季RSV-B占疾病感染優勢；而在2010年夏季到2012年春季RSV-A占疾病感染優勢；在2012年夏季到2013年春季，RSV-B占疾病感染優勢。

綜上世界各地資料，總體上看起來RSV-A在更多地方占疾病感染的優勢地位，但并不是在所有地方都占據優勢，而且同一個地方的不同時間段優勢流行的基因型可不同。目前研究資料提示，相對于RSV-B來說，更多地方RSV-A占據了感染優勢，但沒有某一基因型能穩定地占據流行的主導地位。在某一地區或者某一時間段的疾病感染中，可能出現兩種基因型同時流行的情況，或者其中的某種基因型占優勢的情況[10]。

4 RSV各基因型與呼吸道疾病的嚴重性

RSV的G和F蛋白是病毒中和反應，抗原性和毒力的主要抗原。G蛋白是RSV感染后人體免疫反應的主要靶位(包括F糖蛋白)。G蛋白抗原和基因變異比F蛋白更加頻繁，如此高的變異可能導致G蛋白在促進RSV感染的過程發揮重要作用[13]。

RSV亞型的改變與RSV的反復感染有關。G蛋白相關免疫是基于其對應亞型的特征產生的，不同亞型的G蛋白，不能誘導機體產生不同亞型間交叉保護作用的有效抗體，毒株之間的基因變異可以改變其致病性和逃避免疫防御而復發感染和暴發流行[1，6，10]。

G蛋白胞外區經歷了強烈的陽性選擇，RSV-A的G蛋白就有29個陽性氨基酸選擇位點，比如在GA2與GA3的G蛋白氨基酸序列對比中發現了一些陽性選擇位點(Pro226Leu，Ser269Thr，Pro289Ser和Pro290Leu)。其中的Pro226Leu是用來辨別GA3的位點，而某些位點(226和290)是RSV-A的抗原表位。在嚴重疾病比如細支氣管炎中，氨基酸這些位點的變化可能發揮了重要作用[13]。

很多研究發現，RSV不同基因亞型導致的疾病嚴重程度不同：Goto-sugai等[13]認為，某些RSV基因型和疾病嚴重性的關系存在輕微不同。Goto-sugai等[13]對G蛋白的基因分析時發現，GA3與很嚴重的疾病相關，例如細支氣管炎、肺炎。有報道認為[14]，相對于B7和B9，NA1與嚴重的住院病情更緊密相關。Panayiotou等[3]指出，先前有報道認為RSV-A導致疾病的嚴重性大于RSV-B，而他們的研究提示RSV-BA(屬于RSV-B)導致疾病的嚴重性大于RSV-A。他們還發現，相對于GA2與BA基因亞型，ON1亞型所致疾病較輕。另外，與其它人不同，Goto-sugai等[13]發現，GA2和BA與細支氣管炎相關，而RSV-A所引起疾病的嚴重性與RSV-B所引起疾病的嚴重性沒有明顯不同。

綜上所述，G蛋白的高度變異在RSV病毒感染與復發感染中發揮了重要作用。G蛋白的基因改變是RSV分型的基礎，因此它的變異也是RSV不同亞型導致疾病輕重不同的關鍵。目前對RSV基因型與疾病的相關性研究，已經從討論RSV-A及RSV-B向討論更細的基因亞型過渡，比如BA，ON1，GA2，GA3，GA5等。RSV-A與RSV-B兩者都有可能導致相對嚴重的臨床癥狀，就本文所知，總體上RSV-A比RSV-B導致了更多的嚴重疾病，但其相關性尚未完全明確。RSV-A與RSV-B究竟哪一種更能導致更嚴重的疾病，尚未定論，有待后續更多系統性研究來證實。另外，有報道認為，相對基因型來說，呼吸道所感染的病毒量跟疾病輕重相關性更為明顯[3，13]。

5 展望

我們知道，RSV的基因分型與疾病嚴重性的關鍵，主要源于G蛋白的基因和抗原的改變。但RSV各基因型與疾病的相關性尚未完全明了。RSV各基因型的流行病學資料還不夠齊全，系統闡述尚需進一步的調查研究。

今后應從以下幾個方面努力：①系統地、有計劃地在世界各地進行RSV基因檢測及分型，統計好各地RSV各基因型流行病學資料，建立其全世界范圍的RSV基因型流行病學資料庫。②系統地研究RSV各基因型與所致疾病的關系，統計其與疾病輕重及臨床癥狀的相關性，建立針對特定基因型的預防診療方案。③尋找藥物可以有效作用的RSV基因靶位及其表達抗原，尋找可用于疫苗研制的基因序列。④重視分子診斷技術與醫學交叉結合的學科，開發更先進適用的分子生物學分析技術并應用于臨床診斷治療。

總之，新的分子生物學技術的發展給RSV基因及其分型的研究帶來了極大便利和機遇。繼續推進RSV基因及其分型的研究，會推動RSV疫苗研制和感染風險模型的建立，會給RSV感染的預防、診治、衛生保健等帶來重大幫助。

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