老年哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子水平變化及意義*

楊曉紅，徐慶雷，馬小波，張 巍，劉玲玲，王加平

(1.沭陽縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇沭陽 223600；2.東海縣人民醫(yī)院檢驗科，江蘇東海 222300)

支氣管哮喘(哮喘病)是一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病。研究證實，哮喘病是一種以呼吸道炎癥為病理基礎(chǔ)的慢性氣道炎癥性疾病，中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其中[1～3]。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是具有直接趨化中性粒細(xì)胞作用的細(xì)胞因子，可招募、激活中性粒細(xì)胞[4，5]。髓過氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)屬于亞鐵血紅素酶，在中性粒細(xì)胞中含量較恒定，是與氧化應(yīng)激關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子[6]。本研究以老年哮喘患者為研究對象，檢測其支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中GM-CSF和MPO的水平及中性粒細(xì)胞比例，探討GM-CSF在老年哮喘發(fā)生中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 哮喘急性發(fā)作期老年哮喘患者39例，為2015年1月～12月在沭陽縣人民醫(yī)院呼吸科門診及住院就診患者，其中男性20例，女性19例，平均年齡62±7歲。哮喘患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的“支氣管哮喘防治指南”的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②按照“全球哮喘防治創(chuàng)議”(GINA)方案[8]判斷哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重程度。③72 h內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、受體興奮劑及茶堿類等藥物。

對照組為同期因支氣管異物住院的患者，共35例，其中男性18例，女性17例，平均年齡59±6歲。排除免疫性及過敏性疾病，近期無感染和慢性疾病史。以上各組患者均簽署知情同意書后行纖維支氣管鏡術(shù)及支氣管肺泡灌洗術(shù)(BAL)，同時獲沭陽縣人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與主要試劑 酶標(biāo)儀采用美國Bio-Tek Instruments公司uQuant型，GM-CSF和MPO試劑購自美國RB公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和處理：39例急性發(fā)作期老年哮喘患者分別于入院給予常規(guī)抗哮喘治療，癥狀緩解1天后及經(jīng)過3～6月的控制治療后病情穩(wěn)定，癥狀、體征消失并被確診為臨床緩解時采集標(biāo)本。在完成支氣管術(shù)檢查后行肺泡灌洗術(shù)。第1次灌洗所得BALF送檢病原學(xué)培養(yǎng)，其余灌洗液混勻，1 500 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，沉渣用于細(xì)胞學(xué)分析，上清液置于-70℃保存用于GM-CSF和MPO檢測。

1.3.2 細(xì)胞學(xué)檢查：采用計數(shù)池法對BALF沉渣進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，涂片法進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù)，瑞氏染色法對沉渣涂片進(jìn)行染色，每張涂片計數(shù)500個細(xì)胞，取兩張涂片的平均值。

1.3.3 GM-CSF和MPO檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測GM-CSF和MPO，按照說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測樣本吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度值。

2 結(jié)果

2.1 老年哮喘患者BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率與對照組比較 見表1。

表1 老年哮喘患者BALF中GM-CSF和MPO水平及中性粒細(xì)胞百分率比較

老年哮喘患者急性發(fā)作期、緩解期以及對照組BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率在三組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=45.78～69.21，P均=0.000)。經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，老年哮喘患者急性發(fā)作期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率顯著高于緩解期及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.127～9.080，P均<0.01)；老年哮喘患者緩解期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.153～1.840，P均>0.05)。

2.2 哮喘患者發(fā)作期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率相關(guān)性分析 采用直線相關(guān)分析老年哮喘患者急性發(fā)作期BALF中GM-CSF和MPO水平及NEU百分率之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示GM-CSF和NEU百分率之間呈正相關(guān)(r=0.554，P=0.005)，見圖1。NEU百分率和MPO水平之間呈正相關(guān)(r=0.569，P=0.004)，見圖2。GM-CSF和MPO水平之間呈正相關(guān)(r=0.725，P=0.000)，見圖3。

圖1 老年哮喘患者急性發(fā)作期BALF中GM-CSF和NEU百分率相關(guān)性分析

圖2 老年哮喘患者急性發(fā)作期BALF中NEU百分率與MPO水平相關(guān)性分析

圖3 老年哮喘患者急性發(fā)作期BALF中GM-CSF水平與MPO水平相關(guān)性分析

3 討論

GM-CSF是由內(nèi)皮細(xì)胞等在細(xì)菌脂多糖(LPS)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和TNF-α等炎癥因子的刺激下分泌的一種細(xì)胞因子，屬于糖蛋白，分子量24-33kDa。GM-CSF介導(dǎo)炎性反應(yīng)，發(fā)揮多種重要功能，可趨化、激活中性粒細(xì)胞。體外試驗證實GM-CSF能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生遷移，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF可招募并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向血管外遷移[5]。GM-CSF還可以激活中性粒細(xì)胞并能提高中性粒細(xì)胞壽命和存活能力[9，10]。支氣管上皮細(xì)胞能分泌GM-CSF來維持中性粒細(xì)胞的存活、減緩中性粒細(xì)胞的凋亡[11]。新近的研究發(fā)現(xiàn)GM-CSF參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展，表皮生長因子受體(EGFR)能調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞(AEC)對GM-CSF的分泌，提示EGFR/GM-CSF軸可成為治療哮喘的新靶點[12]。Lee等[13]的研究表明，1，8-桉油素對支氣管上皮細(xì)胞分泌GM-CSF具有抑制作用，能降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性(AHR)并減輕其炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示老年哮喘患者BALF中GM-CSF水平在急性發(fā)作期升高，提示GM-CSF在哮喘急性發(fā)作過程中起著重要作用，GM-CSF可使中性粒細(xì)胞向氣道局部聚集，并將其激活，促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)展。本研究首次探討GM-CSF在老年哮喘患者BALF中水平的變化，既往未見報道。

中性粒細(xì)胞在哮喘的發(fā)病機制中起著重要作用，參與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展[14]。MPO是中性粒細(xì)胞的活化標(biāo)志[15]。MPO是由兩個分子量均為73kDa的單體通過胱氨酸連接成的二聚體，是一種血紅素蛋白的過氧化物酶類。由活化的中性粒細(xì)胞釋放。MPO參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，能使細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化造成細(xì)胞損傷[16，17]。動物研究證實在哮喘大鼠的肺組織切片中支氣管壁及血管壁周圍MPO陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯增高，表明MPO參與了哮喘的發(fā)病機制[18]。本研究結(jié)果顯示哮喘患者急性發(fā)作期BALF中中性粒細(xì)胞比例和MPO水平增高，佐證了這一結(jié)果。提示中性粒細(xì)胞在氣道的聚集與活化參與了哮喘的急性發(fā)作過程，同時也支持MPO參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)之觀點。

本研究結(jié)果提示，GM-CSF參與哮喘的發(fā)病過程。其機制可能是GM-CSF促進(jìn)中性粒細(xì)胞在氣道局部聚集并將其激活，活化的中性粒細(xì)胞釋放MPO等多種酶類進(jìn)而發(fā)生病理反應(yīng)。GM-CSF可作為哮喘患者病情監(jiān)測的有效指標(biāo)，尚需通過大樣本進(jìn)一步研究證實。

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