耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌基因檢測及同源性分析*

陸丹倩，芮勇宇，楊 秋，顧向明，鄧 沖，王巧媚，鄧聚輝

(1．廣東省中山市中醫(yī)院檢驗科，廣東中山 528400；2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州 510515)

鮑曼不動桿菌(acinetobacterbaumannii，Ab)是一種專性需氧的非發(fā)酵革蘭陰性球桿菌，屬于條件致病菌，引起多重耐藥并體外生存時間長(數(shù)月)，易造成流行，對其臨床治療造成較大的困難。鮑曼不動桿菌的耐藥機制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶水解酶，碳青霉烯酶按Ambler法，分為A，B和D三類，本文主要是中山市中醫(yī)院2012～2013年臨床分離出的40株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(CRAB)進行B類金屬酶、D類苯唑西林酶以及ERIC-PCR法聚類分析的研究，以了解我院CRAB的耐藥機制及流行克隆的情況。

1 材料與方法

1.1 研究對象 40株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌來自我院2012年7月～2013年12月住院患者送檢痰液29份、傷口分泌物9份、血液及尿液各1份標本，其中臨床分布ICU 18株、內(nèi)科10株、骨科7株及外科5株，同一患者留取初次分離菌株。

1.2 儀器及試劑 美國BD公司PhoenixTM100全自動細菌及藥敏鑒定儀，PCR擴增儀器(德國Eppendorf)，凝膠成像儀(Bio-Rad)。dNTPs TaqDNA聚合酶、蛋白酶K和DNA Marker由大連瑞真生物技術(shù)有限公司提供。PCR引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、10%十二烷基磺酸鈉由北京鼎國生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 細菌DNA模板制備：用SDS-蛋白酶K-酚-氯仿方法提取，加入適量緩沖液III(10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA)溶解DNA沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR方法檢測常見碳青霉烯酶基因：PCR分別檢測B類金屬酶基因NDM，VIM，IMP[1]，多重PCR同時擴增D類OXA類酶基因OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-51-like，OXA-58-like 4個基因[2]。

1.3.3 ERIC-PCR：進行ERIC-PCR基因分型[3]。1.5 g/dl瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。利用Quantity one 軟件進行ERIC-PCR圖譜的分析。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果 40株CRAB中，OXA-51-like陽性40株占100%，OXA-23-like陽性38株占95%，未檢出NDM，VIM，IPM，OXA-24-like及OXA-58-like。電泳結(jié)果見圖1。

2.2 ERIC-PCR基因分型結(jié)果 相似性聚類分析結(jié)果，40株菌相似水平大于80%(圖中虛線所示)，可認為是同一克隆群。這40株菌在相似水平被聚為33個類群(克隆株)。見圖2。

OXA51 OXA23

圖2 ERIC-PCR基因分型電泳圖譜及聚類圖

3 討論

目前，由于廣譜抗菌素在臨床廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致鮑曼不動桿菌引起的感染檢出率逐年升高，隨多重耐藥、泛耐藥、全耐藥的鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)[4，5]，已成為全球性臨床治療的難題。鮑曼不動桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶是它的主要耐藥機制，碳青霉烯酶主要包括A，B和D三類酶，本文主要針對B類金屬酶，目前常見的NDM，VIM及IPM，D類苯唑西林酶，鮑曼不動桿菌常見OXA-23-like，OXA-24-like，OXA-51-like及OXA-58-like進行檢測。

本實驗檢測40株CAAB的結(jié)果顯示以痰標本最多[6，7]，成為呼吸系統(tǒng)感染的主要致病菌[8]。而分布的科室主要是以ICU為主[9，10]， 這可能與ICU病區(qū)多為老年患者且住院時間長病情嚴重、機體免疫力差，多有嚴重基礎(chǔ)疾病，大量使用廣譜抗生素及各種侵入性檢查和治療等有關(guān)。

碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果顯示未檢出B類金屬酶NDM，VIM及IPM，提示本地區(qū)鮑曼不動桿菌可能未攜帶此3種耐藥基因。D類苯唑西林酶，檢出40株OXA-51-like陽性占100%，38株OXA-23-like陽性占95%，未檢出OXA-24-like及OXA-58-like。說明本地區(qū)鮑曼不動桿菌的基因型是以O(shè)XA-51-like和OXA-23-like為主，與王麗娟等[11]報道一致。OXA-51是鮑曼不動桿菌的重要標志，它是鮑曼不動桿菌的固有基因[12]， 以區(qū)別于其他不動桿菌屬，水解碳青霉烯酶類藥物能力較弱，并不能水解頭孢菌素類藥物。OXA-23能介導(dǎo)細菌耐碳青霉烯類藥物，它是目前流行傳播最廣的D類碳青霉烯類基因，與國內(nèi)外報道一致[13～15]。

為了了解本院近兩年臨床分離出的40株CRAB是否存在醫(yī)院感染流行及暴發(fā)，對臨床分離出的40株CRAB進行ERIC-PCR基因分型，研究其傳播機制。ERIC-PCR是腸桿菌科基因重復(fù)序列為引物進行PCR擴增出多態(tài)性DNA圖譜。它操作簡便、快速經(jīng)濟、重復(fù)性較好，是研究多重耐藥、泛耐藥及全耐藥菌傳播機制的首選方法。檢測的40株菌均能擴增出條帶，分辨率高，40株CRAB菌相似水平大于80%(圖中虛線所示)，可認為是同一克隆群。這40株菌在相似水平被聚為33個類群(克隆株)[16]。

碳青霉烯酶基因檢測及ERIC-PCR基因分型的檢測結(jié)果均顯示，本院近兩年臨床分離出的40株CRAB具有高度的相似性，親緣關(guān)系緊密，可認為是同一克隆群，提示本院存在CRAB的克隆現(xiàn)象可能已經(jīng)發(fā)生，且攜帶OXA-23-like及OXA-51-like基因是引起其耐碳青霉烯類藥物的主要原因之一，而且也是造成CAAB不斷增加的原因。因此，應(yīng)規(guī)范臨床合理使用抗菌藥物，加強對本地區(qū)CRAB耐藥性及耐藥機制的監(jiān)測及關(guān)注，加強手衛(wèi)生，患者隔離，環(huán)境清潔消毒等感控措施，避免在醫(yī)院內(nèi)的進一步傳播，這對指導(dǎo)臨床合理用藥及避免CA-AB醫(yī)院感染暴發(fā)流行具有重要意義。

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