胃癌相關甲基化分型與幽門螺桿菌感染的探討*

朱衛華，劉繼斌，林 蘭(江蘇省南通市腫瘤醫院，江蘇南通 226361)

胃癌(GC)是人類常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關死亡的第二大原因[1]。胃癌預后差仍然是一個重要的臨床挑戰，它對放療和化療相對耐藥因而治療選擇有限[2]。DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究最為廣泛、最重要的表觀遺傳修飾之一。腫瘤甲基化亞型，稱為CpG島甲基化表型(CIMP)，是指出現多基因的甲基化，目前認為是腫瘤新的預后標志[3，4]。胃黏膜幽門螺桿菌感染(H.pylori，HP)是胃癌的高風險因素，一些研究表明，幽門螺桿菌感染與基因啟動子甲基化有關，且與腫瘤的發生發展有關[5，6]。我們重點關注了幽門螺桿菌感染與CpG島甲基化表型(CIMP)在胃癌中的關系，分析了75例胃癌患者血清中相關基因CIMP狀態(APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK和E-cad)和幽門螺桿菌感染在胃癌預后中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2008～2010年期間南通市腫瘤醫院手術切除的經病理明確診斷的胃癌和相應的非癌臨近組織以及配對的血清樣本75例，男性53例，女性22例，年齡31～76歲，平均年齡52.35±7.62歲。2周內未行抗腫瘤治療采集血樣。健康體檢者40例血清作為對照，男性18例，女性22例，2組人員均晨起空腹抽取外周靜脈血。組織標本離體10min內取材，液氮速凍5 min后放置-70℃保存。血清標本，3 000×g離心5～10 min，取上層血清，-80℃低溫冰箱凍存或立即抽提取DNA。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑：PCR產物純化試劑盒(購自上海生工)，MSP mix(TaKaRa熱啟動酶系統)，離心柱型臨床組織基因組DNA提取試劑盒(購自上海閃晶生物公司)，離心柱型臨床血液基因組DNA提取試劑盒(上海閃晶生物公司)；瓊脂糖(Amresco公司)，EZ DNA Methylation-Gold KitTM(美國ZYMO RESEARCH公司)。

1.2.2 主要儀器：德國Biometra溫度梯度PCR擴增儀，ECPS3000/150電泳儀，BECKMAN AllegraTMRA 64R高速低溫離心機，美國BIO-RAD公司凝膠圖像分析儀，博日MiniRun凝膠電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 血漿DNA提取：按上海閃晶生物公司臨床標本基因組DNA抽提試劑盒說明書嚴格操作提取血漿DNA。收集到管內的核酸溶液，紫外分光光度計測定DNA含量，要求吸光度A260nm/A280nm≥1.8，4℃保存備用。

1.3.2 引物設計與合成：根據GenBank設計相關引物甲基化引物，由上海生工公司設計合成，引物序列見表1。

表1 7種基因甲基化引物

注：M.甲基化；U.未甲基化；F.前導鏈；R.后續鏈。

1.3.3 DNA甲基化處理：DNA甲基化處理采用美國ZYMO RESEARCH公司的EZ DNA Methylation-Gold KitTM試劑盒。嚴格按照說明操作。

1.3.4 幽門螺桿菌感染檢測：幽門螺桿菌感染由血清幽門螺桿菌免疫球蛋白G抗體試驗(PBM，普林斯頓，美國)和快速尿素酶試驗(福建三強生物化工有限公司，三明，中國)檢測。血清幽門螺桿菌免疫球蛋白G抗體試驗和快速尿素酶試驗的敏感度≥90%的幽門螺桿菌培養檢測[7]。

1.3.5 所有病例術后進行了兩年隨訪，最后一次隨訪是在2010年9月12日。患者術前未接受化療。中位隨訪期是17.5個月(范圍：8～28個月)。患者均給予體格檢查、腹部超聲、胸部X射線檢查，收集血清，并進行相關腫瘤標志物檢測。在第一年，對局部復發和遠處轉移，每3個月用CT/或MRI成像進行了監測。在75例患者中，13例(17.33%)死于腫瘤相關的原因。17例(22.67%)出現胃癌復發，14例(18.67%)出現胃癌轉移。62例患者在最后一次隨訪時仍存活。

1.4 統計學分析 本資料采用SPSS 13.0統計軟件，計數資料用百分數表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床相關資料 腫瘤大小平均為3.8 cm(范圍2.5～9.6 cm)。據Edmondson-Steiner分期，分類為Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅲ期40例，Ⅳ期7例。根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)(格林，佛羅里達州等，2002年)第6版TNM分期，Ⅰ期24例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例。

分析了75例腫瘤病人以及健康對照組相關標本7種基因APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK-3和E-cad啟動子甲基化狀況。結果顯示：對照組均未發現相關基因啟動子的甲基化改變，75例病人中有69例出現一個甚至多個基因的甲基化改變，胃癌組織和相關血液中相關基因甲基化頻率均超過15%，其中APC在胃癌組織為48%，在血清為30.67%；WIF-1在胃癌組織為57.33%，在血清為34.67%；RUNX-3在胃癌組織為56%，在血清為37.33%；DLC-1在胃癌組織為50.67%，在血清為29.33%；SFRP-1在胃癌組織為52%，在血清為33.33%；DKK-3在胃癌組織為54.67%，在血清為32%；E-cad在胃癌組織為48%，在血清為26.67%。按照相關研究標準[8]，75例相關胃癌樣本被分為CIMP+(≥3甲基化基因)或CIMP-(兩個或更少的甲基化基因)。在本研究中，由于臨界值為3，腫瘤組織中的甲基化基因數平均為3.6，而血清中的甲基化基因數為2。腫瘤組織樣本中，47例(62.67%)樣本被劃分為CIMP+，28例(37.33%)被劃分為CIMP—。血清樣本中，44例(58.67%)被劃分為CIMP+，31例(41.33%)被劃分為CIMP-。非腫瘤組織和健康對照組血清均為CIMP-。

2.2 胃癌中幽門螺桿菌感染及相關資料 經檢測發現75例胃癌樣本中有51例(68%)幽門螺桿菌感染陽性，24例(32%)未感染。在51例幽門螺桿菌陽性胃癌組織中，發現36例CIMP+和15例CIMP-。而24例未感染胃癌組織中11例CIMP+，13例CIMP-。幽門螺桿菌陽性組和陰性組CIMP表達差異有統計學顯著性意義(χ2= 4.27，P<0.05)，51例幽門螺桿菌陽性血清樣本中，34例CIMP+和17例CIMP-；24例未感染血清樣本中，10例CIMP+，14例CIMP-。兩組間差異有統計學顯著性意義(χ2= 4.21，P<0.05)。

2.3 CIMP在幽門螺桿菌感染的胃癌預后中價值 經過兩年隨訪，有3例HP+/CIMP+病人失訪；31例HP+/CIMP+病人中，有9例出現了轉移，10例出現了復發，7例死亡；17例HP+/CIMP-病人中，有2例發生了轉移，3例出現了復發，2例死亡；發現HP+/CIMP+和HP+/CIMP-兩組轉移率明顯不同，HP+/CIMP+病人有轉移傾向(χ2=3.593，P<0.05)；HP+/CIMP+組復發率明顯高于HP+/CIMP-組(χ2=2.369，P<0.05)；生存率二者未見明顯不同(χ2=1.043，P>0.05)。

3 討論

近年來，表觀遺傳改變已被認為是腫瘤發生的重要早期事件[9]。富含CpG島的DNA啟動子區異常甲基化是表觀遺傳沉默的關鍵環節。異常基因表達可能是腫瘤的早期事件，是腫瘤早期發現的潛在生物標志物[10]。研究證實基因的異常甲基化可作為肝癌發生風險的篩選指標，基因的甲基化與預后明顯相關[11]。也有研究認為基因甲基化檢測在胃癌早期診斷中的價值很高，特異度高，是一種有效的診斷方式，在患者的臨床診斷方面擁有廣闊的治療前景[12]。

研究發現，幽門螺桿菌感染的胃黏膜活檢標本中DNA異常甲基化是胃癌高發的危險因素[13]，血液中白細胞的重復元件低甲基化與惡性胃黏膜病變以及胃癌進展相聯系[13]。近年來，術語“CIMP”已被用于各種胃癌表觀研究中。近年來幽門螺桿菌感染與多基因甲基化的關系已有了一些探討，但很少有人關注CIMP與幽門螺桿菌與胃癌的關聯或血清中CIMP與胃癌中幽門螺桿菌之間存在的關聯。本研究中我們收集了胃癌病人的組織和血清以及健康對照的相關組織和血清并進行了7個腫瘤相關基因(APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK-3和E-cad)CIMP狀態的檢測。我們發現對照組均未發現相關基因啟動子的甲基化改變，胃癌組織和血清中相關基因甲基化頻率均超過15%，也許多基因甲基化狀態改變可能對胃癌的早期診斷具有一定幫助。我們還發現血清中DNA啟動子區甲基化對腫瘤相關基因是高度特異的，并且與腫瘤組織結果是相似的。我們檢測了75例胃癌樣本中的CIMP狀態，發現組織與血清具有很好的一致性。

75例胃癌樣本中有51例(68%)幽門螺桿菌感染陽性，24例(32%)未感染。胃癌中幽門螺桿菌是很普遍的，這表明預防和治療胃癌根除幽門螺桿菌感染可能是必要的。CIMP狀況在腫瘤預后中的價值已在多種腫瘤中進行了論證，食管腺癌中，CIMP與預后不良相關[15]。幽門螺桿菌也是胃癌預后的一個因素，我們研究發現CIMP與幽門螺桿菌之間存在關聯。幽門螺桿菌還可引起宿主DNA損傷并改變DNA甲基化干擾下游信號[16]。

經過兩年隨訪，發現HP+/CIMP+和HP+/CIMP-兩組轉移率明顯不同，HP+/CIMP+病人有轉移傾向(P<0.05)；復發率HP+/CIMP+組明顯高于HP+/CIMP-組(P<0.05)；生存率二者未見明顯不同(P>0.05)。因此，異常的DNA甲基化可能與慢性炎癥有關。多重的調控暗示DNA甲基化是在宿主對幽門螺桿菌感染的反應中扮演了一個重要角色。幽門螺桿菌通過降低DNA修復基因的表達促進遺傳不穩定性[17]。經過兩年隨訪后，我們發現HP+/CIMP+與胃癌病人的轉移和復發相關，與生存關系不大。提示HP+/CIMP+參與了胃癌的發生發展過程，與生存無關也許是因為隨訪時間太短，結果有待進一步驗證。

總之，我們研究發現胃癌患者血清DNA啟動子區異常甲基化是具有很高的特異性的，并且與組織具有很好的一致性。因此血清中CIMP檢測具有和組織中相似的結果，可以很好解決標本來源受限的相關病人的檢測，并為預后的研究提供便利，解決臨床實際標本困難。因而血清中CIMP檢測是一個穩定的有用的胃癌預后監測指標。本研究由于研究病例相對較少，腫瘤相關基因也少，因而相關結果有待大樣本證實。由于隨訪時間較短，僅僅兩年，可能相關結論有些偏差，需要大樣本長期隨訪進一步驗證。

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