革蘭陽性球菌對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制的研究*

許宏濤，陳東科，賴惠英(北京醫(yī)院檢驗(yàn)科 國家老年醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730)

利奈唑胺(linezolid，LZD)是一種新型惡唑烷酮類抗生素，2000年在美國上市，主要應(yīng)用于萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)、青霉素耐藥鏈球菌等多重耐藥革蘭陽性球菌的治療。因?yàn)樽匀唤缰腥狈μ烊荒退幓驇欤碚撋喜灰壮霈F(xiàn)利奈唑胺耐藥；但事實(shí)并非如此，2001年美國哈弗大學(xué)醫(yī)學(xué)院報(bào)道了第一株利奈唑胺耐藥的MRSA[1]。而后，多個(gè)國家出現(xiàn)了利奈唑胺耐藥葡萄球菌的暴發(fā)性流行。我們收集了2012年1月～2014年12月我院臨床標(biāo)本中出現(xiàn)的6株利奈唑胺耐藥革蘭陽性球菌，對(duì)分子流行病學(xué)及其主要耐藥分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2012年1月～2014年12月我院臨床標(biāo)本中對(duì)利奈唑胺耐藥的革蘭陽性球菌6株，經(jīng)過VITEK2 COMPACT鑒定5株為柯氏葡萄球菌、1株為糞腸球菌。

1.2 試劑 KB法藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基干粉及E-test藥敏條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；Vitek-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；ABI-2400 PCR儀購自美國ABI公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自凱捷公司；TaqDNA聚合酶、dNTP和DNA分子量Marker購自日本TaKaRa公司。PCR引物合成由北京賽百盛公司完成。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用E-test法檢測(cè)利奈唑胺、青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬古霉素、替考拉寧、環(huán)丙沙星、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素的MIC；藥敏方法和折點(diǎn)判斷參照CLSI 2012，以ATCC29213作為質(zhì)控菌株。

1.4 利奈唑胺耐藥基因及相關(guān)突變檢測(cè) 細(xì)菌基因組DNA提取應(yīng)用凱捷公司的基因組提取試劑盒，23Sr DNA V區(qū)域引物及4個(gè)拷貝基因片段引物[2]，L3和L4[3]，cfr[4]基因擴(kuò)增條件及引物序列參照文獻(xiàn)進(jìn)行，引物序列見表1；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定由上海生工公司完成。

1.5 柯氏葡萄球菌PFGE分析 5株柯氏葡萄球菌進(jìn)行了脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)，染色體DNA制備及電泳條件參照Murchan等[11]的文獻(xiàn)進(jìn)行，條帶分析應(yīng)用軟件BioNumerics software package (version 5.10， Applied Maths Inc.，Austin，TX，USA)完成。

2 結(jié)果

2.1 抗生素敏感試驗(yàn) 見表2。5株柯氏葡萄球菌利奈唑胺MIC介于16～64 mg/L，青霉素、苯唑西林及頭孢西丁均耐藥，萬古霉素及替考拉寧敏感；糞腸球菌利奈唑胺MIC為8 mg/L，萬古霉素及替考拉寧顯示敏感。

2.2 利奈唑胺耐藥基因及相關(guān)突變檢測(cè)結(jié)果 5株柯氏葡萄球菌均表現(xiàn)為cfr基因陽性(圖1)，23Sr RNA及L4無突變，L3存在兩對(duì)氨基酸突變，具體見表1；糞腸球菌cfr基因擴(kuò)增陰性，存在23SrRNA點(diǎn)突變(表2)。

表1 本研究所應(yīng)用引物序列

表2 6株革蘭陽性球菌主要耐藥機(jī)制及抗生素敏感性

注：MIC，最低抑菌濃度；LZD，利奈唑胺；PEN，青霉素；OXA，苯甲異噁唑青霉素；FOX，頭孢西丁；VAN，萬古霉素；TEC，替考拉寧；CIP，環(huán)丙沙星；ERY，紅霉素；TET，四環(huán)素；CHL，氯霉素；S：絲氨酸；Y：酪氨酸；D：天冬氨酸；F：苯丙氨酸。

M：分子量Marker；ATCC29213：陰性對(duì)照。

2.3 柯氏葡萄球菌PFGE分型結(jié)果 見圖2。5株柯氏葡萄球菌PFGE分型共分為2型，分別定義為A型和B型，菌株432和485為A型，437，438和470為B型。

3討論利奈唑胺2007年在中國上市，主要用于治療多重耐藥革蘭陽性球菌；耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，我國第一株利奈唑胺耐藥革蘭陽性球菌出現(xiàn)在2009年[5]。利奈唑胺通過與50S核糖體亞基23Sr RNA的V功能區(qū)結(jié)合，阻止50S與30S亞基組合成70S核糖體，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮抗菌作用。現(xiàn)在已知的利奈唑胺耐藥機(jī)制包括：23SrRNA V結(jié)構(gòu)區(qū)的點(diǎn)突變，以G2576T為主，還包括U2500A，G2505A，G2512T，T2504C，C2610G，T2505A及G2766T等，這些突變影響利奈唑胺與靶位的結(jié)合從而減弱利奈唑胺抗菌活性[6]；此外，有學(xué)者報(bào)道[7]核糖體蛋白L3或L4突變與利奈唑胺抗菌活性下降相關(guān)，菌株通過核苷酸片段的缺失、序列改變、替換以及插入修飾編碼核糖體蛋白L4，L3的rpl/D，rpl/C基因序列，從而影響肽酰轉(zhuǎn)移酶的空間構(gòu)象，降低抑制利奈唑胺的抗菌活性，從而達(dá)到耐藥，這種突變多發(fā)生于細(xì)菌染色體上，故不易造成細(xì)菌間耐藥性的橫向傳播；第三種已知耐藥機(jī)制是菌株通過獲得cfr耐藥基因而達(dá)到耐藥[8]，首次報(bào)道于臨床分離的MRSA菌株中。cfr基因可甲基化轉(zhuǎn)錄后的rRNA(A2503)，從而使其構(gòu)象改變以影響利奈唑胺與抗菌靶位的結(jié)合而引起耐藥，大量文獻(xiàn)顯示：cfr耐藥基因可通過質(zhì)粒在不同種屬細(xì)菌間進(jìn)行水平傳播，而引起醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)流行[9]。此外，cfr耐藥基因還可介導(dǎo)對(duì)氯霉素及林可霉素的交叉耐藥，由此可見cfr基因是利奈唑胺耐藥菌株醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行的潛在危險(xiǎn)因素。

注：菌株485，432：PFGE A型；菌株470，438，437：PFGE B型。

我們的研究中利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌經(jīng)鑒定全部為柯氏葡萄球菌，其它凝固酶陰性葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)利奈唑胺耐藥，5株菌均來自患者無菌部位并伴隨感染癥狀，鑒定其均為感染菌；5株柯氏葡萄球菌耐藥分子機(jī)制均表現(xiàn)為cfr基因陽性伴隨L3的158位及159位突變，未見23SrRNA突變及L4的突變；cfr基因多見于質(zhì)粒，容易引起醫(yī)院內(nèi)播散；L3突變最近報(bào)道較多，但在利奈唑胺耐藥中cfr基因及L3突變同時(shí)存在時(shí)其分別所起的作用及程度還需要在以后研究中明確，這也是我們下一步研究的目標(biāo)。而利奈唑胺耐藥糞腸球菌分離自患者尿標(biāo)本，耐藥由23SrRNA的G2576T點(diǎn)突變引起，以往研究顯示：糞腸球菌中，編碼23S rRNA的基因有4個(gè)相同的片段(拷貝)，其突變的數(shù)量與耐藥水平呈量效關(guān)系，糞腸球菌(菌株號(hào)501)的23SrRNA第5功能區(qū)的PCR擴(kuò)增片段測(cè)序2576位為單一峰，顯示其為一致性的G到T的點(diǎn)突變，此株糞腸球菌未檢測(cè)出cfr基因及L3和L4的突變。

在分子流行病學(xué)研究中我們應(yīng)用PFGE技術(shù)對(duì)5株柯氏葡萄球菌進(jìn)行了親緣性研究，結(jié)果顯示：菌株432和485為同一分子克隆(A型)，它們來自同一病房(ICU)的病人，且485被分離前病人未應(yīng)用過利奈唑胺抗生素，提示菌株有播散的可能；另外三株菌(437，438和470)為PFGE分型的B型，病人在分離出利奈唑胺耐藥菌株前均應(yīng)用過利奈唑胺藥物，分子遺傳背景相同提示其存在院內(nèi)傳播可能。

近年利奈唑胺耐藥的革蘭陽性球菌已在國內(nèi)多家醫(yī)院臨床標(biāo)本中檢測(cè)出[10]，其為革蘭陽性球菌的有效抗感染治療帶來了困難；臨床微生物室應(yīng)加強(qiáng)利奈唑胺耐藥革蘭陽性球菌的監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)合理應(yīng)用抗生素的宣教，以減少多重耐藥菌的出現(xiàn)。

[1] Tsiodras S，Gold HS，Sakoulas G，et al．Linezolid resistance in a clinical isolate ofStaphylococcusaureus[J]．Lancet，2001，358(9277)：207-208．

[2] Mendes RE，Deshpande LM，F(xiàn)arrell DJ，et al．Assessment of linezolid resistance mechanisms amongStaphylococcusepidermidiscausing bacteraemia in Rome，Italy[J]．The Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2010，65(11)：2329-2335．

[3] Toh SM，Xiong L，Arias CA，et al．Acquisition of a natural resistance gene renders a clinical strain of methicillin-resistantStaphylococcusaureusresistant to the synthetic antibiotic linezolid[J]．Molecular Microbiology，2007，64(6)：1506-1514．

[4] Kehrenberg C，Schwarz S．Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistantStaphylococcusisolates[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2006，50(4)：1156-1163．

[5] Zhao C，Sun H，Wang H，et al．Antimicrobial resistance trends among 5 608 clinical Gram-positive isolates in China：results from the Gram-Positive Cocci Resistance Surveillance program (2005～2010)[J]．Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2012，73(2)：174-181．

[6] LaMarre J，Mendes RE，Szal T，et al．The genetic environment of the cfr gene and the presence of other mechanisms account for the very high linezolid resistance ofStaphylococcusepidermidisisolate 426-3147L[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2013，57(3)：1173-1179．

[7] Locke JB，Hilgers M，Shaw KJ．Mutations in ribosomal protein L3 are associated with oxazolidinone resistance instaphylococciof clinical origin[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53(12)：5275-5278．

[8] Liu Y，Wang Y，Schwarz S，et al．Transferable multiresistance plasmids carrying cfr inEnterococcusspp．from swine and farm environment[J]．Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2013，57(1)：42-48．

[9] Morales G，Picazo JJ，Baos E，et al．Resistance to linezolid is mediated by the cfr gene in the first report of an outbreak of linezolid-resistantStaphylococcusaureus[J]．Clinical Infectious Diseases，2010，50(6)：821-825．

[10] 蔡加昌，周宏偉，胡燕燕，等．耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究[J]．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012，32(6)：532-536．

Cai JC，Zhou HW，Hu YY，et al．Linezolid resistance mechanisms and molecular epidemiology of clinical isolates of methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci[J]．Chin J Microbiol Immunol，2012，32(6)：532-536．