miR-205在ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義*

鄧順江，黃韋華，吳林洪，張 蕾，葉 辛，劉 鵬，李騰達(dá)，龍曙萍，錢 琤，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003；4.解放軍第100醫(yī)院，江蘇蘇州 215007)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)被認(rèn)為是一種由自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增加以及生成減少引起的疾病，臨床上以血小板計(jì)數(shù)減少和皮膚黏膜出血為特點(diǎn)[1]。但研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為ITP的發(fā)病是一個(gè)多步驟的過(guò)程，各種免疫細(xì)胞包括T,B細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞以及相關(guān)的細(xì)胞因子在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2～6]。

Micro-RNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度大約為22個(gè)核苷酸的微小非編碼RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[7]，因而參與體內(nèi)多種生理病理過(guò)程。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，最近有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在ITP的發(fā)病中也發(fā)揮了重要的作用[8～10]。例如，miR-155在ITP患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中表達(dá)上調(diào)，而在治療后表達(dá)下調(diào)[11]；miR-302c-3p，miR-483-5p等miRNA在ITP兒童患者的血漿中表達(dá)水平升高。然而，ITP患者中具體有哪些miRNA表達(dá)異常目前還有待進(jìn)一步研究，miRNA在ITP的發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制至今還未闡明。

我們前期通過(guò)基因芯片的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-205在ITP患者中表達(dá)明顯上調(diào)，此次研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)患者PBMC中miR-205的表達(dá)水平，并分析其與患者血小板計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供新線索。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取長(zhǎng)海醫(yī)院2014～2015年收治的ITP患者外周抗凝全血43例，其中男性21例，女性22例，年齡為22～63歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國(guó)專家共識(shí)(修訂版)”[12]，且均未接受過(guò)相關(guān)治療。同時(shí)選取體檢中心健康對(duì)照組38例，其中男性20例，女性18例，年齡為20～62歲，每例標(biāo)本大約2 ml。ITP組和健康對(duì)照組在年齡和性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒(購(gòu)自takara公司)；Trizo試劑(Invitrogen life technologies)；淋巴細(xì)胞分離液，氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇，異丙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DEPC水，dd水，紅細(xì)胞裂解液，2 ml EP管，200 μl EP管，Centrifuge 5417 R低溫高速離心機(jī)，純水儀，紫外分光光度計(jì)(ND-1000，Nanodrop Technologies)，梯度PCR儀(ABI)，PCR儀(ABI7500)。

1.3 檢測(cè)方法 外周血PBMC的分離和總RNA的提取：用淋巴細(xì)胞分離液從EDTA-K2抗凝的2 ml靜脈中分離PBMC，用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)(ND-1000，Nanodrop Technologies)檢測(cè)所提取RNA的濃度及純度。

CDNA的合成以及Real-timePCR反應(yīng)miR-205以及U6的特異引物由上海賽百勝公司設(shè)計(jì)和合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用定量PCR試劑盒進(jìn)行核酸擴(kuò)增，試劑盒購(gòu)自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄和PCR條件嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 ITP患者分組標(biāo)準(zhǔn) 選取的未經(jīng)治療的ITP患者歸為初診組(naive ITP group)，ITP患者的治療符合國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[12]，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)治療后：血小板>100×109/L且病情穩(wěn)定的患者歸完全緩解組(Complete remission group，CR group)，共14例；血小板<100×109/L的患者或治療有效但復(fù)發(fā)的患者歸不完全緩解組(incmplete remission group，IR group)，共29例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Studentttests)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)miR-205的表達(dá) 與38例正常對(duì)照組相比，43例ITP初診患者(Naive ITP)PBMC miR-205的表達(dá)水平更高(1.81±0.48 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.31，P<0.01)；治療后不完全緩解組(IR group)和初診患者相比，miR-205的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.112)，與正常對(duì)照組相比，則表達(dá)升高(1.63±0.65 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.2，P<0.01)；14例治療后完全緩解組(CR group)治療后(After treatment)PBMC miR-205的表達(dá)低于治療前(Before treatment)的表達(dá)水平(1.07±0.43 vs 1.91±0.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.68，P<0.01)。

2.2 相關(guān)性分析 ITP患者PBMC miR-205與血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ITP患者PBMC miR-205與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.069 6，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

3 討論

MicroRNA是一種微小(19～23個(gè)核苷酸)的單鏈非編碼RNA，通過(guò)結(jié)合mRNA的3’非翻譯序列區(qū)(3’untranslated sequence region，3’-UTR)而使mRNA降解或者抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，一個(gè)microRNA可能結(jié)合多個(gè)mRNA，一個(gè)mRNA也可能被多個(gè)microRNA所調(diào)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)microRNA在多種疾病狀態(tài)下存在異常的表達(dá)，提示其參與了人體的發(fā)病過(guò)程。miR-205的編碼基因LOC642587定位于染色體1q32.2區(qū)，miR-205的前體位于LOC642587的第二個(gè)內(nèi)含子和第三個(gè)外顯子鏈接的區(qū)域，是一個(gè)高度保守的microRNA，在多種疾病中都表現(xiàn)出異常的表達(dá)，比如Duan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-205通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因SMAD2而抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，miR-205的表達(dá)低于癌旁組織。有研究[15，16]發(fā)現(xiàn)miR-205抑制其靶基因MLL-AF4的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而MLL-AF4是一種可以引起急性白血病的致癌基因，miR-205高表達(dá)的最終結(jié)果是抑制細(xì)胞的增殖，這給急性白血病的治療找到了新的突破口。Hu等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-205通過(guò)抑制其靶基因VEGFA和FGF2從而增加了乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度。

圖1 原發(fā)性血小板減少癥(ITP)患者PBMC miR-205表達(dá)水平與血小板計(jì)數(shù)結(jié)果的相關(guān)性

ITP是臨床上常見(jiàn)的由血小板減少和破壞增多而引起的自身免疫性血液系統(tǒng)疾病。血小板的數(shù)量在一定程度上反映了TIP的嚴(yán)重程度，患者血小板計(jì)數(shù)結(jié)果越低，表明患者病情越重，反之則病情相對(duì)較輕。本次研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC中miR-205表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，并且miR-205的表達(dá)水平與患者外周血血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，這提示miR-205可能參與了ITP的發(fā)病，并且可能與ITP 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，癥狀越嚴(yán)重的患者，其miR-205的表達(dá)水平也越高。另外我們對(duì)43例ITP初診患者進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)29例未完全緩解組miR-205的表達(dá)水平和初診時(shí)相比基本未改變，而14例完全緩解組治療后miR-205的表達(dá)水平與治療前相比，顯著降低，這也提示了miR-205與ITP的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。但miR-205是如何影響血小板的數(shù)量的，是作用于哪個(gè)靶基因以及通過(guò)什么信號(hào)通路而參與到ITP的發(fā)病與預(yù)后還有待進(jìn)一步探索。

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