實驗性血管性癡呆大鼠模型的實時步態行為分析

研究報告

實驗性血管性癡呆大鼠模型的實時步態行為分析

關亞蘭1，董世芬1，張勝威1，孫建寧1，劉振權2

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京100102；2.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京100029)

【摘要】目的建立實驗性血管性癡呆大鼠模型，研究其實時步態行為。方法采用雙側頸總動脈結扎方法建立大鼠血管性癡呆模型，術后50 d進行實時步態行為訓練與測試，記錄步行速度、步行周期、步幅、步基、支撐時長、擺動時長等指標共計96項。結果與假手術組比較，實驗性血管性癡呆模型組大鼠有19項步態指標出現了顯著地統計學差異，模型動物步態行為異常主要體現在前肢步寬增加(P < 0.05)，各足步行周期延長(P < 0.05)，各足支撐時長增加(P < 0.05，P < 0.01)，擺動時長縮短(P < 0.05)，同源協調性降低(P < 0.05)，各足足跡平均面積和平均強度增加(P < 0.05，P < 0.01)。結論實驗性血管性癡呆大鼠模型實時步態行為異常與臨床患者所見癥狀相似，可為該模型的建立和判斷提供借鑒。

【關鍵詞】血管性癡呆；大鼠模型；實時步態行為

[基金項目]北京中醫藥大學青年教師專項計劃，抗栓素治療血管性癡呆作用機制研究(2012-QNJSZX006)；北京中醫藥大學自主課題，血管性癡呆動物模型步態變化與腦部病變相關性研究(2014-JYBZZ-XS-095)。

[作者簡介]關亞蘭(1987-)，女，在讀研究生，研究方向：中藥防治心腦血管疾病研究，yalan-guan@foxmail.com。

[通訊作者]劉振權(1976-)，男，副教授，碩士生導師，研究方向：中醫藥防治腦血管病研究，lzqbzy@sina.com。

【中圖分類號】R331 R332【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.011

Experimental vascular dementia rats model of

real-time gait behavior analysis

GUAN Ya-lan1，DONG Shi-fen1，ZHANG Sheng-wei1，SUN Jian-ning1，LIU Zhen-quan2

(1.School of Chinese Material Medical, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China；

2.Basic medical, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China )

Abstract【】ObjectiveTo establish experimental vascular dementia rat model and evaluate gait behavior. Methods Vascular dementia rat model induced by bilateral carotid artery ligation methods, 50 days for real-time gait behavioral training and testing after surgery. ResultsCompared with the sham group, Experimental vascular dementia model rats had 19 gait indicators appeared significantly statistical difference, Animal model gait abnormal behavior is mainly reflected in the forelimb step width increased (P < 0.05), each foot walk cycle extension (P < 0.05), Each foot stance time increased (P < 0.05, P < 0.01), and the swing time shortened (P < 0.05), Homologous coupling shortened (P < 0.05), each foot average footprint area and average intensity increased (P < 0.05, P < 0.01). Conclusion Experimental rat model of vascular dementia in real time gait abnormal behavior and seen in patients with clinical symptoms similar, can provide a reference model for the establishment and judgment.

【Key words】Vascular dementia；Rat model；Gait behavior

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由各種腦血管病引起的腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合征。隨著我國社會老齡化，血管性癡呆已經超越阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)成為最常見癡呆病類型[1]。近年來，臨床醫生和研究人員在評估老年人的身體狀況時，分別進行步態和認知能力的評估。臨床實踐、流行病學研究和臨床試驗中越來越多的證據顯示在老年患者中步態和認知存在著內在的關聯性。在老年患者中，可量化的步態改變與摔倒，癡呆和殘疾相關[2]。對于老年人來說，步態和認知障礙主要反映了連接著大腦基質和病理學的兩種老年綜合征的共同出現，步態的控制更多的是由前額皮質調節，這與大腦回路控制的執行控制和注意力功能重疊。這種回路容易受到多種與年齡相關的病理影響，例如局部缺血、炎癥、神經退行性病變，這些因素最終導致認知、步態或者兩者組合的損傷。同時，有新的證據表明，在認知過程的早期干擾中，例如，注意力、執行功能、工作記憶在單一和一心二用的試驗測試中都與緩慢步態和步態不穩相關，而這些認知障礙有助于預測未來執行功能的喪失，摔倒和發展為癡呆[3]。

目前，絕大多數針對血管性癡呆模型大鼠的藥物的藥效學研究都集中在改善模型動物學習和記憶障礙等藥理作用[4]，但是關于血管性癡呆大鼠步態行為的改變未見有報道，本課題對這方面進行了初步的探索。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠40只，雌性大鼠20只，體重230 g左右，雄性大鼠20只，體重360 g左右，由軍事醫學科學院動物中心提供【SCXK(軍)2012-0004】。動物設施使用許可證【SYXK(京)2011-0024】，室溫22℃～25℃，相對濕度65%，12 h明暗交替環境中適應3 d后進入實驗。

1.2主要儀器

大小鼠步態分析處理系統(彩插7圖1-a)，GAS-2，北京鑫海華儀科技有限公司。

1.3方法

1.3.1實驗方法

將實驗大鼠按體重隨機分為兩組，即假手術組和模型組。模型的制備方法：以10%水合氯醛按0.35 g/kg腹腔注射麻醉，固定，消毒，無菌手術，分離雙側頸總動脈，用一號手術絲線進行永久性結扎，縫合肌肉皮膚。術后，模型組動物有死亡，最終假手術組(共20只，雌雄各10只)，血管性癡呆模型組(共12只，雌雄各6只)。

1.3.2實時步態分析訓練方法

訓練方法：大鼠造模后50 d需進行行走步態儀的訓練，為期7 d，訓練方法如下述：準備一空鼠盒，先將動物轉移該鼠盒內，將飼養大鼠的鼠盒置于步態儀后端的鼠盒托架中，以建立一個熟悉的環境。將一只大鼠置于步態儀前端的采樣跑道上，并且從動物后方給相應刺激直至動物跑完全程(彩插7圖1-b)，并進入分析儀后端暗箱中，并且堵上暗箱入口，讓該動物在其中適應30 s，如果動物適應完暗箱環境后沒有從暗箱的出口跳入下方的飼養鼠盒內，可以人為將動物置于該鼠盒中，可以認定成功完成一次訓練。此種方法完成該鼠盒內所有動物的訓練，直到所有動物都在飼養鼠盒中，再適應1 min，完成一輪訓練。每只動物每天訓練3次，連續訓練7 d，直至所有的動物在沒有刺激的條件下可以不停頓地完成在跑道上的行走。檢測方法：訓練結束后，進行3次實時步態行為錄像(彩插7圖1-c和d)。之后用專用分析軟件分析，取各個指標均值。

2結果

2.1步態參數

使用步態儀器自帶軟件系統對結果進行分析，最終得到96個步態指標，其中有統計學差異的指標有19項，將這些有差異的指標分成4大類進行分析，包括：體態輪廓參數，步態距離參數，步態時間參數，空間參數。

2.2血管性癡呆大鼠步態行為檢測結果

2.2.1體態輪廓的參數結果

速度是指在一次行走過程中，步長的總和/步長周期的總和。平均體轉角是指老鼠嘴尖與尾根形成的軸線的方向和正前方向軸之間的夾角的平均值。平均體轉角本質上反應的是動物的整體定位。體轉角標準差是指老鼠嘴尖與尾根形成的軸線方向和正前方向軸之間的夾角的標準偏差。平均側向移動是指，動物質量中心延Y軸側向移動的距離。平均側向移動標準差是指，動物質量中心延Y軸側向移動的標準偏差。與假手術組大鼠比較，模型組大鼠平均體轉角較假手術組減小，而體轉角標準差較假手術組增加，平均側向移動和側向移動標準偏差較假手術組均減小。具體結果見表1：

2.2.2步態距離的參數結果

步寬是指在行走中左、右兩足間的距離，通常以足爪中點為測量參考點。步幅是指動物在一個步行周期中，同一前肢或后肢連續兩個最大腳印橫坐標中點之間的距離。與假手術組比較，模型組前肢步寬顯著增加(P< 0.05)，右前足步幅顯著降低(P< 0.05)，具體結果見表2：

2.2.3步態時間參數結果

2.2.3.1步態時間參數-步行周期結果

步行周期是指動物行走時一側足跟著地到該側足跟再次著地的過程被稱為一個步行周期，分為支撐相和擺動相。與假手術組比較，模型組左前足、左后足和右前足步行周期顯著延長(P< 0.05)，具體結果見表3：

2.2.3.2步態時間參數-支撐時長結果

支撐時長是指在一個步行周期中動物四足始終與地接觸的階段，與假手術組比較，模型組左前足、左后足和右后足支撐時長顯著延長(P< 0.05，P< 0.01)。具體結果見表4：

表1　體態輪廓的參數結果

注：與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2　步態距離參數(毫米)

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3　步行周期(秒)

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表4　支撐時長(秒)

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2.3.3步態時間參數-擺動時長結果

擺動時長是指在一個步行周期中動物四足始終與地無接觸的階段。與假手術組比較，模型組右前擺動時長顯著延長(P< 0.05)。具體結果見表5：

2.2.3.4步態時間參數-制動指數結果

制動指數是指從該足開始接觸時刻到該足與地面最大接觸面積時刻所需的時長(即爪子踩地時間)/支撐時長。與假手術組比較，模型組右前制動指數顯著增加(P< 0.05)。具體結果見表6：

2.2.3.5步態時間參數-推進指數結果

推進指數是指從該足與地面最大接觸面積時刻到該足離地時刻所需的時長(即抬起爪子時間)/支撐時長。與假手術組比較，模型組右前推進指數顯著增加(P< 0.05)。具體結果見表7：

2.2.3.6步態時間參數-支撐時相結果

支撐時相是指支撐時長所占步態周期的百分數(cycle%)作為單位來表達。與假手術組比較，模型組左前足和左后足的支撐時相顯著增加(P< 0.05,P< 0.01)；具體結果見表8：

2.2.3.7步態時間參數-擺動時相結果

擺動時相是指擺動時長所占步態周期的百分數(cycle%)作為單位來表達。與假手術組比較，模型組左前足和左后足擺動時相顯著降低(P< 0.05,P< 0.01)，具體結果見表9：

表5　擺動時長(秒)

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表6　制動指數結果

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表7　推進指數結果

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表8　支撐時相結果

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2.3.8步態時間參數-同源協調性結果

同源協調性是指被觀測足爪(RH)的擺動時間或支撐時間與對照足爪(LH)的步行周期的比值。與假手術組比較，模型組左前足相對于右前足的同源協調性顯著降低(P< 0.05)，右后相對于左后的同源協調性顯著降低(P< 0.05)；具體結果見表10：

2.2.4空間參數結果

2.2.4.1空間參數結果-足跡最大面積

足跡最大面積是指足爪接觸地面最大面積。與假手術組比較，模型組左后足跡最大面積顯著增加(P< 0.05)，左后足跡平均強度顯著增加(P< 0.05)；具體數值見表11：

2.2.4.2空間參數結果-足跡平均面積

足跡平均面積是指每幀圖像足跡面積之和/總幀數。與假手術組比較，模型組左后足跡平均面積顯著增加(P< 0.01)，具體數值見表12：

2.2.4.3空間參數結果-足跡平均強度

足跡平均強度是指每幀圖像足跡強度之和/總幀數。與假手術組比較，模型組左后足跡平均強度顯著增加(P< 0.01)。具體數值見表13：

表9　擺動時相結果

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表10　同源協調性結果

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表11　足跡最大面積 (mm 2)

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P<0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表12　足跡平均面積 (mm 2)

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表13　足跡平均強度

注：Rf：右前肢，Lf：左前肢，Rh：右后肢，Lh：左后肢，與假手術組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Rf: right forepaw; Lf: left forepaw; Rh: right hindpaw; and Lh: left hindpaw. Compared with the Sham group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3討論

目前，血管性癡呆所致的異常步態，以及阿爾茨海默病動物模型步態的研究鮮有報道。由于外傷，局部缺血，神經退行性病變或炎癥均可引起的中樞神經的損傷，而這些損傷均可導致其運動系統功能障礙。準確可靠的疾病模型動物運動功能的檢測，不僅對評價治療方法、療效有重要的意義，而且有助于揭示研究神經退行性疾病發病病理機制。

神經性步態行為異?？梢宰鳛槔夏晷园V呆特別是血管性癡呆發生發展的可靠預測因素。臨床研究表明，血管性癡呆的步態行為異常主要表現為步態不穩、額葉步態以及偏癱型步態。步態不穩是指身體不穩、失去平衡，走路時摔倒，直線行走或者轉彎的同時將一只腳放在另一只腳的正前方；額葉步態是指小步幅、大步基、抬腳離開地面較困難；偏癱步態是指步行有停滯現象且患側為足尖步態并畫圈。有文獻報告稱血管性癡呆患者相較于阿爾茨海默癥患者有著更好的言語記憶，但是存在著更差的執行功能的缺陷。也有學者認為特殊亞型的步態異常與增加癡呆風險相關，其中，額葉步態在老年患者中可能是由腦血管疾病引起的。另一方面，步態不穩在老年人中的預測作用也是值得關注的，步態不穩可能是由多種與年齡相關以及與疾病相關的各種神經解剖部位的改變導致的，可以作為腦血管損傷的標記，對癡呆做出解釋[5-6]。臨床步態分析中最常用的是步行時相四期分析法，即兩個雙支撐相、一個單支撐相、一個擺動相。健全人平地行走時理想狀態是左右對稱的，兩個雙支撐相大致相等，約各占步行周期12%時間；支撐相約占步行周期60%～62%(包括雙支撐相)時間，擺動相約占步行周期38%～40%時間。當一腿有疾患時，由于患腿往往不能負重，傾向于健側負重，故患側支撐相所占時間相對減少，健側支撐相所占的時間相對增加。

本實驗采用雙側頸總動脈結扎的方法建立實驗性血管性癡呆大鼠模型。雙側頸總動脈結扎法是通過阻斷動物雙側頸總動脈外加動脈放血而形成的全腦缺血。早期可造成急性腦缺血，而后可通過基底動脈和Willis環血流調節以逐漸形成的側支循環所改善和代償，造成一種慢性腦低灌注狀態，可損傷動物的運動功能，并造成認知障礙。本實驗中模型動物左前足、左后足和右后足的支撐時長增加，即動物的這些足爪與地面接觸的時間延長，而右前足支撐時長沒有顯著的變化，結合臨床現象推測，模型動物的患側可能為右前足，繼續分析，右前足擺動時長增加，即動物足爪與地面無接觸的時間延長；右前推進指數的增加說明動物抬起右前足爪的時間在支撐時長所占的比例增大；動物右前制動指數的減少，即動物右前足爪踩地的時間在支撐時長所占的周期減小。這些步態指標的變化和臨床中異常步態的表現是一致的。實驗性血管性癡呆大鼠模型實時步態行為異常與臨床患者所見癥狀相似，可為該模型的建立和判斷提供借鑒。

除了臨床常見的步態指標，實驗性動物步態指標檢測添加了制動指數，推進指數和協調性指數等相關方面的參數，臨床上該參數的設置較少報道。這也為臨床提供參考，在步行功能檢測中設置更多的物理參數，從而更好的了解腦神經功能，將腦神經功能劃分的更細微，為臨床治療血管性癡呆提供更好的向導。當前，臨床上已經開始探討步態異常與相關腦功能的聯系，為治療此類疾病提供理論依據[7-8]。但是從臨床患者身上獲取該信息的難度要遠高于從實驗動物身上獲取信息。接下來，我們會集中精力研究血管性癡呆動物所表現的步態異常與腦組織病變的相關性，為臨床治療提供理論參考。

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[8]Annweiler C, Beauchet O, Bartha R,etal. Motor cortex and gait in mild cognitive impairment: a magnetic resonance spectroscopy and volumetric imaging study[J]. Brain, 2013, 136(3): 859-871.

〔修回日期〕2014-09-01