藍氏賈第鞭毛蟲診斷

技術方法

藍氏賈第鞭毛蟲診斷

高正琴，賀爭鳴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

【摘要】目的藍氏賈第鞭毛蟲作為一種重要的人獸共患寄生蟲病賈第蟲病的病原，其對SPF實驗動物質量造成的潛在威脅不容忽視。本研究的目的是建立藍氏賈第鞭毛蟲快速診斷方法，并對17個生產廠家516批2562只SPF實驗動物檢查結果進行分析。 方法用直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法，對藍氏賈第鞭毛蟲進行檢測。 結果在SPF實驗動物中檢出數量眾多的藍氏賈第鞭毛蟲滋養體和包囊，鑒定出藍氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因。直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法均能檢出藍氏賈第鞭毛蟲。17個生產廠家516批2562只SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲陽性檢出率22.9%(586/2562)。 結論直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法具有高度的敏感性和特異性，可用于藍氏賈第鞭毛蟲的快速診斷。17個生產廠家516批SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲檢查結果未能全部符合規定。

【關鍵詞】藍氏賈第鞭毛蟲；直接鏡檢；快速姬姆薩染色；多重PCR；SPF實驗動物；質量分析

[基金項目]國家科技支撐課題(2013BAK11B01)。

[作者簡介]高正琴(1976-)，女，副研究員，研究方向：病原生物學和快檢新技術研究。

[通訊作者]賀爭鳴(1957-)，男，研究員，研究方向：實驗動物微生物學。

【中圖分類號】R332【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.014

Diagnoses ofGiardialamblia

GAO Zheng-qin，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei

(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 10050, China)

Abstract【】ObjectiveGiardia lamblia is an important pathogen of zoonosis giardiasis, it poses a potential threat to the quality of SPF (specific pathogen-free) laboratory animals cannot be ignored. The aim of this study is to establish the method of rapid diagnosis of Giardia lamblia, and analyze the test results of 516 batches form 17 manufactures. Methods Direct microscopy, Giemsa-fast staining and multiplex polymerase chain reaction (multiplex PCR) were applied to detect Giardia lamblia.ResultsNumerous of Giardia lamblia trophozoites and cysts were detected in SPF laboratory animals by using direct microscopy and Giemsa-fast staining, and multiplex PCR were performed to identify 18S rDNA, β-giardin, TPI and GDH genes of DNA extracted from these trophozoites and cysts identified Giardia lamblia. Direct microscopy, Giemsa-fast staining, and multiplex PCR methods can be used to detect Giardia lamblia. Of the 2562 SPF laboratory animals studied, 22.9% (586/2562) were positive for Giardia lamblia.ConclusionsDirect microscopy, Giemsa-fast staining, and multiplex PCR were effective techniques with high sensitivity and specificity for rapid diagnosis of Giardia lambliain. It is not satisfactory that the results of Giardia lamblia examination in 516 batches form 17 manufactures failed to meet the requirements 100%.

【Key words】Giardialamblia；Direct microscopy；Giemsa-fast staining；Multiplex polymerase chain reaction；Specific pathogen-free laboratory animal；Quality analysis

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)是一種呈全球性分布的寄生性腸道原蟲，引起以腹瀉、吸收障礙和消化不良為主的藍氏賈第鞭毛蟲病(giardiasis，簡稱賈第蟲病)，也是HIV/AIDS合并感染機會原蟲。藍氏賈第鞭毛蟲感染在旅游者中流行引起的腹瀉，也稱“旅游者腹瀉”。目前，賈第蟲病已被列為全世界危害人類健康的十種主要寄生蟲病之一[1-5]。

近年來，無特定病原體(specific pathogen-free，SPF)實驗動物已廣泛應用于食品藥品生物制品醫療器械的檢定和研究。中華人民共和國國家標準(GB/T 14922.1—2001)規定：鞭毛蟲(flagellates)是SPF實驗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬、猴均應排除的寄生蟲項目之一，但國家標準中未列出藍氏賈第鞭毛蟲的檢測方法[6-7]。因此，快速準確檢測藍氏賈第鞭毛蟲是一個重要問題。目前，尚未見不同方法檢測SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲的報道和有效數據。本研究建立了藍氏賈第鞭毛蟲直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR檢測方法，對17個生產廠家516批2562只SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲進行檢測，對檢測的準確性進行評估，并對檢驗結果進行分析討論，希望對SPF實驗動物生產廠家及檢驗單位有參考作用，從而共同提高SPF實驗動物的質量，防止藍氏賈第鞭毛蟲污染。

1材料和方法

1.1儀器設備

生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國)；LEICA DM2500生物顯微鏡(Leica Microsystems，德國)；倒置顯微鏡及成像系統(Nikon，日本)；二氧化碳培養箱(北京五洲東方科技發展有限公司)；基因擴增儀(Applied Biosystyem，美國)；凝膠成像分析系統(東樂自然基因生命科學公司)。

1.2樣品來源

本試驗所用樣品來自17個生產廠家516個批次2562只SPF實驗動物。對于猴、犬活體采集新鮮糞便，對于兔、豚鼠、地鼠、大鼠、小鼠則安樂死后采集腸樣本。

1.3直接鏡檢

取待測樣本，放入潔凈離心管中，加入生理鹽水，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，吸取中上層液體滴片，直接鏡檢，采用實時動態顯微視頻攝錄結果。

1.4快速姬姆薩染色

取待測樣本，放入潔凈離心管中，加入磷酸鹽緩沖液稀釋，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，吸取中上層液體滴片，用新鮮配制的姬姆薩快速染色，采用實時動態顯微視頻攝錄結果。

1.5蟲體離體生存能力試驗

取待測樣本，放入潔凈離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，1000 × g離心5 min，棄上清，沉淀重新以磷酸鹽緩沖液吹打懸浮，小心收集數條鮮活蟲體，放置于新鮮配制的含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養液中，37℃ 5% CO2實驗條件下放置，倒置顯微鏡下觀察蟲體存活狀態，實時拍攝記錄結果。

1.6 多重PCR

針對藍氏賈第鞭毛蟲18S r DNA、β-giardin(β-賈第蟲素)、磷酸丙糖異構酶(triose phosphate isomerase，TPI)和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)基因設計四對引物。多重PCR引物名稱、序列和產物大小見表1。同上收集SPF實驗動物樣本中的數條鮮活蟲體，放置于潔凈離心管中，用德國Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按說明書操作快速提取樣品基因組DNA。以抽提的DNA為模板，同時用剛地弓形蟲、結腸小袋纖毛蟲、四翼無翅線蟲DNA作為藍氏賈第鞭毛蟲多重PCR擴增時的陰性對照。PCR總反應體系為50 μ L，包括10 × Buffer (Mg2+Plus) 5.0 μ L、dNTP Mixture 4.0 μ L、正反向引物(1.0 μmol/μL)各0.5 μ L、EX Taq(5 U/μ L)0. 25 μ L、模板DNA 2.0 μL、nuclease-free water 37.75 μL。循環參數：94℃ 5 min 1 循環；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35 循環；72℃ 10 min 1 循環。瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴增產物。

表1　多重PCR引物

2結果

2.1直接鏡檢結果

吸取SPF實驗動物腸樣本中鮮活蟲體，快速滴片，實時動態顯微視頻攝錄記載蟲體形態特征及運動方式：高倍鏡下觀察，可見數量眾多的鞭毛蟲滋養體(trophozoite)和包囊(cyst)。外觀略顯無色透明的鮮活的鞭毛蟲滋養體借助鞭毛擺動快速翻滾運動，鞭毛蟲包囊移行速度較慢。鞭毛蟲滋養體呈縱切為半的倒置梨形，大小為(8～16)μm ×(5～12)μm，前端寬鈍，后端尖細，腹面扁平，背部隆起，兩側對稱，有前、后側、腹側和尾鞭毛共四對。鞭毛蟲包囊為橢圓形，大小為(8～12)μm ×(7～10)μm(彩插8圖1)。依據鞭毛蟲滋養體和包囊大小形態特征及運動方式，鑒定為藍氏賈第鞭毛蟲[8]。

2.2快速姬姆薩染色結果

用新鮮配制的姬姆薩液，對SPF實驗動物腸樣本中鮮活蟲體進行快速染色，實時動態顯微視頻攝錄記載蟲體形態特征及運動方式：高倍鏡下觀察，可見大量藍色半透明鞭毛蟲滋養體和包囊。滋養體呈典型的“笑臉樣”特征，一對細胞核位于蟲體前端1/2的吸盤部位。一對前鞭毛由此向前伸出體外，其余三對發出后在兩核間沿軸柱分別向體兩側、腹側和尾部伸出體外。未成熟包囊內含2個細胞核，成熟包囊內含4個細胞核(彩插8圖2)。依據鞭毛蟲滋養體和包囊大小形態特征及運動方式，鑒定為藍氏賈第鞭毛蟲。

2.3蟲體離體生存能力試驗結果

將從SPF實驗動物腸樣本中收集到的藍氏賈第鞭毛蟲鮮活蟲體，37℃ 5% CO2實驗條件下放置，結果發現：在37℃藍氏賈第鞭毛蟲滋養體能夠存活一周。第4天時，蟲體四對鞭毛齊全，結構完整，運動自如(彩插8圖3)。第8 天后，蟲體部分鞭毛脫落，結構松散，無自主運動能力，出現死亡(封3圖4)。

2.4多重PCR結果

在上述收集到的SPF實驗動物數條鮮活蟲體樣品中均檢出藍氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI 和GDH 基因特異性DNA片段(大小分別為190 bp、231 bp、290 bp和356 bp)，而作為陰性對照的剛地弓形蟲、結腸小袋纖毛蟲、四翼無翅線蟲樣本卻未觀察到目的基因片段擴增。SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲多重PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果(封3圖5)。藍氏賈第鞭毛蟲多重PCR擴增獲得了清晰特異的18S rDNA、β-giardin、TPI 和GDH基因目的條帶，分子鑒定結果證明SPF實驗動物自然感染的確實是藍氏賈第鞭毛蟲。

結果顯示，直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法均能檢出藍氏賈第鞭毛蟲。在SPF實驗動物中檢出數量眾多的藍氏賈第鞭毛蟲滋養體和包囊，鑒定出藍氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因。17個生產廠家516批2562只SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲陽性檢出率22.9%(586/2562)。

3討論

藍氏賈第鞭毛蟲同種異名腸賈第蟲(Giardiaintestinalis)或十二指腸賈第蟲(Giardiaduodinalis)，簡稱賈第蟲，隸屬于雙滴蟲目(Diplomonadida)，六鞭毛科(Hexamitidae)，賈第鞭毛蟲屬(Giardia)。藍氏賈第鞭毛蟲滋養體最先由荷蘭學者Antonivan Leeuwenhoek(1632-1723)于1681年在自己腹瀉的糞便內發現。藍氏賈第鞭毛蟲包囊由Grassi于1879年發現。1888年Blanchard[9]將該蟲命名為Lamblia intestinalis。1915年Kofoid[10]提出改為Giardialamblia。

藍氏賈第鞭毛蟲是典型的真核生物，厭氧，缺乏線粒體氧化磷酸化的或任何組件。本文作者在37℃ 5% CO2實驗條件下研究發現，SPF實驗動物鮮活藍氏賈第鞭毛蟲蟲體離體能存活一周。藍氏賈第鞭毛蟲生活史簡單，包括滋養體和包囊兩個階段。滋養體為營養繁殖階段，包囊為傳播階段。滋養體主要寄生于十二指腸、小腸、大腸，蟲體借助吸盤吸附于腸絨毛表面，以二分裂方式進行繁殖，在腸道內環境不利情況下，分泌囊壁形成包囊并隨糞便排出體外。Bingham等[11]人研究了物理因素參與的藍氏賈第鞭毛蟲脫囊和生存能力，在實驗室條件下包囊8℃存活77 d，21℃存活5～24 d，37℃存活不超過4 d。包囊在水中和涼爽環境中可存活數天甚至數月之久。人和動物攝入被包囊污染的飲水或食物而被感染。成熟的4核包囊被宿主吞食后，在十二指腸內脫囊形成2個滋養體。Rendtorff[12]研究發現人類被藍氏賈第鞭毛蟲感染的劑量僅為10個包囊。

18S rDNA為rDNA基因中進化相對保守的部分，含有大量物種間進化的信息。β-giardin是藍氏賈第鞭毛蟲的一種結構蛋白，為滋養體腹吸盤的一部分，TPI、GDH基因屬于基因組中進化較快的部分。本研究應用多重PCR技術獲得了SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲18S rDNA、β-giardin、TPI和GDH基因的片段，多位點測序和基因分型工作正在進行，為進一步開展藍氏賈第鞭毛蟲遺傳多樣性研究奠定了基礎。

本研究對SPF實驗動物自然感染的藍氏賈第鞭毛蟲進行了病原學和分子診斷。在SPF實驗動物樣本中發現了藍氏賈第鞭毛蟲的滋養體和包囊，蟲體鮮活數量眾多。應用實時動態顯微視頻攝錄技術跟蹤監測寄生蟲，獲得了藍氏賈第鞭毛蟲滋養體和包囊典型特征形態及獨特運動方式的寶貴視頻資料。應用多重PCR技術，從分子水平上對SPF實驗動物自然感染的藍氏賈第鞭毛蟲進行多基因特征確認，為快速準確鑒別診斷藍氏賈第鞭毛蟲感染提供了有效方法。

綜上所述，直接鏡檢法、快速姬姆薩染色法和多重PCR方法具有高度的敏感性和特異性，可用于藍氏賈第鞭毛蟲的快速診斷。17個生產廠家516批SPF實驗動物藍氏賈第鞭毛蟲檢查結果未能全部符合規定。藍氏賈第鞭毛蟲作為一種重要的人獸共患寄生蟲病賈第蟲病的病原，其對SPF實驗動物質量造成的潛在威脅不容忽視。SPF實驗動物已廣泛應用于食品藥品生物制品醫療器械的檢定和研究，人獸共患寄生蟲感染會造成嚴重不良后果。

參考文獻：

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[11]Bingham AK, Jarroll EL Jr, Meyer EA, Radulescu S: Giardia sp.: physical factors of excystation in vitro, and excystation vs eosin exclusion as determinants of viability [J]. Exp Parasitol 1979, 47:284-291.

[12]Rendtorff RC. The experimental transmission of human intestinal protozoan parasites. II. Giardia lamblia cysts given in capsules [J]. Am J Hyg. 1954; 59:209-220.

〔修回日期〕2014-12-08