伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌屬及其生物膜代謝影響研究

伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌屬及其生物膜代謝影響研究

祖力卡爾江·阿合買提1， 李艷2， 孟凡琦1， 趙今1

(1新疆醫科大學第一附屬醫院牙體牙髓科·新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所， 烏魯木齊830054;

2新疆醫科大學第五附屬醫院口腔科, 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討伊犁黑蜂蜂膠乙醇提取物(Ethanol extract of Propolis, EEP)與氟化鈉(NaF)對致齲變形鏈球菌屬產酸、產糖代謝關鍵酶乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)與葡萄糖基轉移酶(Glycosyltransferase, GTF)及基因表達的影響及其防齲機制。方法分別培養游離狀態與生物膜狀態下生長的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌，以含梯度濃度EEP的腦心浸液培養基(Brian Heart Infusion,BHI)作為實驗組,50 mg/L NaF的BHI培養基作為陽性對照組,以不添加任何藥物的BHI培養基作為陰性對照組。各組與不同生長狀態的細菌作用18 h。采用還原性輔酶I氧化法測定乳酸脫氫酶活性。硫酸銨鹽析結合超濾離心法提取GTFs粗酶，蒽酮法測定GTFs活性。RT-qPCR法測定各組LDH編碼基因ldh表達和各組GTFs編碼基因gtfb、gtfc、gtfd表達。結果在游離狀態與生物膜狀態下，變形鏈球菌、遠緣鏈球菌各實驗組和NaF組LDH活性均明顯受到抑制(P<0.05)。在游離狀態和生物膜狀態下，EEP組、NaF組變形鏈球菌GTFs活性沒有變化(P>0.05)。游離狀態時，變形鏈球菌、遠緣鏈球菌實驗組和NaF組ldh表達明顯受到抑制(P<0.05)；生物膜狀態下，變形鏈球菌實驗組在1、1/2、1/4MBEC濃度時ldh表達受到抑制(P<0.05)，遠緣鏈球菌實驗組在1、1/2、1/4、1/8MBEC濃度時ldh表達受到抑制(P<0.05)，NaF組細菌在ldh表達差異沒有統計學意義(P>0.05)。游離狀態與生物膜狀態下，變形鏈球菌實驗組gtfb、gtfc、gtfd基因表達與陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05)。游離與生物膜生長狀態下，變形鏈球菌NaF對gtfb基因表達有促進作用(P<0.05)。結論伊犁黑蜂蜂膠是通過抑制產變形鏈球菌屬糖代謝途徑LDH活性及其轉錄來抑制變形鏈球菌產酸，從而達到防齲的效果。

關鍵詞：蜂膠； 變形鏈球菌屬； 乳酸脫氫酶； 葡萄糖基轉移酶； 熒光定量PCR

中圖分類號：R780.1文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.011

[收稿日期：2015-04-08]

基金項目：新疆重大疾病醫學重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地開放課題(SKLIB-XJMDR-2014-Y3)

作者簡介：賀家勇(1974-)，男，本科，主治醫師，研究方向：腫瘤的基礎與臨床研究。

In vitro study of effect in Yili dark propolis on Mutans Streptococci

metabolism in both planktonic and biofilm state

Zulkar Ahmat1, LI Yan2, MENG Fanqi1, ZHAO Jin1

(1DepartmentofEndodontics,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity.

ResearchInstitutionofStomatologyofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China;

2DepartmentofStomatology,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo expolore effect of ethanol extract of Propolis (EEP) and NaF on bacteria′s lactate dehydrogenase(LDH) and glycosyltransferase(GTFs) activity and transcription of related coding gene on mechanism of Caries-preventive. MethodsStreptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in both planktonic and biofilm state were incubated,which were interacting with BHI culture medium which containing various concentration of EEP; BHI culture medium which containing 50mg/L NaF, and BHI culture medium were interacted for 18 hours. Coenzyme I reduced method was used to assay LDH activity of each group. GTFs crude enzyme was extracted from supernatant ;anthrone method was used to calculate GTF activity .Total RNA was extracted by Trizol, and levels of ldh gtfb, gtfc, gtfd were tested by means of RT-qPCR. ResultsThe significant inhibition of LDH activity found between all study groups and NaF group compared to negative control in both planktonic and biofilm of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus after interaction (P<0.05). As for planktonic state of Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus, after interaction with all groups, significant down-regulation of ldh was detected in both study group and NaF group (P<0.05). ldh down-regulation ratio in study group was greater than NaF group (P<0.05); to the state of biofilm, Streptococcus mutans after interaction with all groups, study groups contain MBEC，1/2,1/4MBEC EEP significantly down-regulated ldh expression compared to the negative control (P<0.05); for Streptococcus sobrinusbiofilm, all concentrations of EEP in study group significantly down-regulate ldh expression compared to the negative control (P<0.05). While NaF group in neither Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus didn't show difference to negative control (P>0.05). In both planktonic and biofilm state of Streptococcus mutans, expression of gtfb, gtfc, gtfd weren't affected by EEP in study group, as for positive control group, NaF upregulated the gtfb expression. ConclusionPossible mechanism of Yili dark Propolis inhibiting acid production of Mutans Streptococci is inhibiting LDH activity as well as down regulating ldh gene expression in both planktonic and biofilm state. Propolis has little affect on the GTF activity and gtfs gene expression.

Key words: propolis; Mutans Streptococci; lactate dehydrogenase; glycosyltransferase; real-time PCR

變形鏈球菌、遠緣鏈球菌與人類齲病發生關系最為密切[1]。有效控制口腔菌斑中變形鏈球菌屬及其毒力因子可以降低齲病的發生。乳酸脫氫酶(LDH)與葡萄糖基轉移酶(GTF)是變形鏈球菌屬糖代謝途徑中的關鍵酶。由于化學藥物控制口腔微生物有著諸多局限性[2-3]，天然藥物防齲逐漸成為了防齲研究的熱點。蜂膠是一種藥理作用非常寬泛的天然藥物[4-6]。有大量研究發現蜂膠有防齲活性[4-5,7-8]。然而，蜂膠的化學組成與藥理活性因地域、氣候及植物來源不同而呈現高度的異質性[9-13]，且蜂膠防齲機制尚未明確。本課題組為探討伊犁黑蜂蜂膠可能的防齲機制，對變形鏈球菌致齲毒力因子的影響進行了系列研究，前期研究發現伊犁黑蜂蜂膠對不同狀態下變形鏈球菌屬的生長、產酸毒力因子有顯著的抑制作用，對變形鏈球菌產糖毒力因子有抑制活性,并測得伊犁蜂膠乙醇提取物對變形鏈球菌最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)及最低生物膜清除濃度(Minimum biofilm eradication concentration, MBEC)[5]。為進一步研究伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌產酸、產糖抑制機制，本研究通過伊犁黑蜂蜂膠對不同狀態下變形鏈球菌乳酸脫氫酶、葡萄糖基轉移酶及其編碼基因的影響，分析伊犁黑蜂蜂膠抑制變形鏈球菌產酸、產糖的原因，并探討其可能的防齲機制。

1材料與方法

1.1實驗菌株與菌液制備國際標準菌株變形鏈球菌(Streptococcus mutans ATCC25175)、遠緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus ATCC 6715)購于美國ATCC公司(American Type Culture Collection)。BHI血瓊脂平板上分別接種變形鏈球菌與遠緣鏈球菌凍干株，80%氮氣、20%二氧化碳、37℃條件下厭氧培養48 h后，觀察平板有無菌落生長或菌落生長形態，隨機選取幾個單個菌落革蘭氏染色顯微鏡下觀察鑒定，確定純培養后，再次挑取典型菌落接種于BHI血瓊脂平板，80%氮氣、20%二氧化碳、37℃條件下厭氧培48 h，挑取形態均勻的單菌落放入BHI液體培養基，采用Mcfarland法調定細菌懸液濃度約為3×106暫存。

1.2實驗藥品的制備 新疆伊犁黑蜂蜂膠醇粗提物制備蜂膠采自伊犁尼勒克縣種蜂場。將粗蜂膠置于-20℃冰箱中過夜后在研缽內粉碎，使用水浴法(m∶v=1∶8)在70℃下水浴除蠟，再用冷浸法提純蜂膠。稱取15 g除蠟蜂膠粉碎后按照固液比1∶5的比例，加70%乙醇75 mL，封口后浸泡2 w。濾去沉渣，蜂膠原重量減去沉渣干燥后的重量，配制成100 mg/mL蜂膠乙醇溶液，用1 mol/L NaOH調整pH=7.0后經0.22 μm的無菌濾器過濾備用。

1.3實驗儀器與試劑超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，核酸蛋白測定儀(美國Thermo scientific 型號Nanodrop 1000)，常規PCR 儀(美國伯樂Bio-Rad，型號 C100)，實時熒光PCR儀(美國伯樂型號 CFX96)。伊犁黑蜂蜂膠(新疆伊犁尼勒克縣種蜂場)，腦心浸液培養基(Brain Heart Infusion，BHI：美國BD)，脫纖維蛋白無菌羊血(新疆醫科大學實驗動物中心提供),乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物有限公司，批號：A020-2)，Trizol裂解液(美國 Invitrogen，批號 93908-520)，SYBRGreen Master Mix(美國Thermo scientific,批號00166002)，RevertAidfirst strand cDNA Synthesis kit反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo scientific,批號00145469)。

1.4不同狀態細菌的培養游離狀態：15 mL無菌離心管內加入1 mL菌懸液與5 mLBHI液體培養基，輕搖混勻，封口膜封閉管口，放入搖床，280 r/min、37℃下厭氧培養24 h。生物膜狀態： 6孔細菌培養板分別加入細菌懸液 1 mL和5 mL含1%蔗糖BHI液體培養基(pH=7.0)混勻，37℃下厭氧培養24 h后觀察有無細菌生物膜形成。

1.5實驗分組根據本課題組前期實驗得到伊犁蜂膠乙醇提取物對變形鏈球菌的最低抑菌濃度 (Minimum Inhibitory Concentration, MIC)為0.78 mg/mL;對變形鏈球菌生物膜的最低生物膜清除濃度(Minimum biofilm eradication concentration, MBEC)為6.25 mg/mL；對遠緣鏈球菌的MIC為0.39 mg/mL，MBEC為1.56 mg/mL[5]。本實驗采用完全隨機設計,根據MIC與MBEC濃度劃分實驗組。每組樣本設立6個平行樣本，每個樣本測定2次以減少隨機誤差。不同生長狀態變形鏈球屬菌分組：陰性對照組：未加入任何藥物的BHI液體培養基(pH=7.0)。陽性對照組：含50 mg/L氟化鈉BHI液體培養基(pH=7.0)。游離實驗組：分別含1、1/2、1/4、1/8MIC濃度EEP的BHI液體培養基(pH=7.0)。生物膜實驗組：分別含1、1/2、1/4、1/8MBEC濃度EEP的BHI液體培養基(pH=7.0)。

1.6乳酸脫氫酶活性測定分別收集藥物作用后不同狀態組細菌沉淀，加5 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.2)重懸2次，以1 mL含5 mg/mL溶菌酶TRIS-HCL緩沖液混勻懸浮37℃孵育1 h；冰浴下瞬時多次超聲破碎菌細胞，20 KHz,功率300 W。將產物4℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定各個樣本蛋白濃度，采用還原性輔酶I法，用乳酸脫氫酶試劑盒測定各個樣本乳酸脫氫酶活性，具體操作步驟：按照表1在各個反應孔中加入相應的試劑并吹打混勻，37℃孵育15 min；在各個孔中加入25 μL二硝基苯肼混合均勻，37℃孵育15 min，加入250 μL 0.4 mol/L NaOH混勻，室溫放置5 min，全波長酶標儀測定450 nm吸光值(每個樣品設立2個副孔控制系統誤差)。乳酸脫氫酶活性的計算：乳酸脫氫酶活性(IU/L)=(測定管吸光度值-對照管吸光度值)÷(標準管吸光度值-空白管吸光度值)。

表1　乳酸脫氫酶活性測定操作步驟/μL

1.7葡萄糖基轉移酶活性測定分別向各組離心收集的菌細胞沉淀加入0.4 mol/L 氫氧化鈉溶液5 mL反復吹打重懸、離心3次(10 000 r/min，10 min)，收集上清液，以葡聚糖為標準品，蒽酮法測定多糖含量。分別收集各組離心收集的培養基上清液，向其中少量多次加入固體硫酸銨達到60%濃度，4℃下放置24 h；12 000 r/min，離心30 min，收集沉淀，加入5 mL磷酸鹽緩沖液溶解；將溶解液轉入孔徑為10 Kd超濾離心管(12 000 r/min，15 min)離心2次，棄去管底水；收集超濾離心管濾膜以上葡萄糖基轉移酶粗酶，PierceBCA蛋白定量分析試劑盒測定粗酶濃度(具體操作步驟嚴格按照生產商說明書法微孔檢測方案)。將測定胞外多糖以及粗酶濃度的數據導入到Excel 2010，并使用Excel 2010對導入數據進行處理與儲存，制作標準曲線，計算酶活性。

1.8RT-qPCR 測定ldh、gtfb、gtfc、gtfd基因表達情況逆轉錄實時熒光定量PCR操作步驟：將藥物作用18 h的菌液，4℃、10 000 r/min 離心30 min，收集細菌沉淀，按照TRIZOL試劑說明書進行細菌總RNA的提取。用反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒、RevertAid first strand cDNA Synthesis kit:(Thermo scientific)進行RNA的反轉錄。目的基因引物序列為：內參基因16srRNA上游序列5′-GGCGACGCTCTTGATCTTAG-3′，下游序列5′-GGTTAGCAGCAACGAGGAAG-3′：ldh基因上游引物序列5′-GGCGACGCTCTTGATCTTAG-3′,下游序列5′-CTACGCATTTCACCGCTACA-3′；gtfb基因上游引物序列5′-TGCCGCAGTCCCTTCTTATTC-3′,下游序列5′-GCCATGTATTGCCCGTCATCT-3′；gtfc基因上游引物序列5′-GTGCGCTACACCAATGACAGAG-3′,下游序列5′-GCCTACTGGAACCCAAACACCTA-3′；gtfd基因上游引物序列5′-TACCTTGGGCACCACAACACT-3′,下游序列5′-TGCCGCCTTATCATCCTCACT-3′。實時熒光定量PCR半定量測定基因表達的反應體系為：cDNA模板2 μL，PCR 上游引物0.4 μL(10 μM)，PCR 下游引物0.4 μL(10 μM)，SYBR Green Mix 12.5 μL， ddH2O29.7 μL，總體系25 μL。反應條件：預變性95℃ 30 s后40個循環(95℃，5 s變性； 60℃，30 s延伸；60℃~95℃繪制溶解曲線)。每個樣品設立2個副孔。結果利用2-△△CT法對其進行分析：分別求出6個平行樣本待測基因和內參基因16sRNA平均Ct值后，應用內參基因16sRNA對同種培養狀態下的未用藥組和用藥組進行校正：△Ct(對照組)=對照組X基因Ct值-對照組16RNA基因Ct值；△Ct(待測組)=待測組X基因Ct值-待測組16sRNA基因Ct值。對照組和待測組的△Ct進行歸一化：△△Ct=△Ct(待測樣本)-△Ct(校準樣本)；根據△△Ct算出待測組與對照組間X基因的表達差異(W)：W=2-△△CT。

2結果

2.1蜂膠對變形鏈球菌屬乳酸脫氫酶的影響

2.1.1各組藥物對游離生長狀態變形鏈球菌屬乳酸脫氫酶活性的影響在游離生長狀態下，變形鏈球菌、遠緣鏈球菌各實驗組和陽性對照組乳酸脫氫酶活性均明顯受到抑制(P<0.05)。變形鏈球菌實驗組在1、1/2MIC濃度時，乳酸脫氫酶活性低于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；變形鏈球菌實驗組在1/8MIC濃度時及陰性對照組乳酸脫氫酶活性高于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；遠緣鏈球菌實驗組在1、1/2、1/4MIC濃度時乳酸脫氫酶活性低于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組乳酸脫氫酶活性高于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.1.2各組藥物對生物膜生長狀態變形鏈球菌屬乳酸脫氫酶活性的影響在生物膜生長狀態下，變形鏈球菌、遠緣鏈球菌各實驗組乳酸脫氫酶活性明顯受到抑制(P<0.05)。陽性對照組與陰性對照組相比乳酸脫氫酶活性明顯受到抑制(P<0.05)。變形鏈球菌實驗組在1、1/2MBEC濃度時，乳酸脫氫酶活性低于陽性對照組，在1/8MBEC濃度時，乳酸脫氫酶活性高于陽性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。遠緣鏈球菌實驗組在1、1/2、1/4MBEC濃度時，乳酸脫氫酶活性低于陽對照性組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

組別藥物變形鏈球菌遠緣鏈球菌1MICEEP0.627±0.0596*△0.457±0.0400*△1/2MICEEP0.909±0.0231*△0.652±0.0745*△1/4MICEEP1.403±0.0892*1.028±0.0742*△1/8MICEEP1.641±0.0880*△1.394±0.0735*陽性對照NaF1.318±0.1168*1.528±0.0990*陰性對照無1.822±0.0147△1.826±0.0116△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05; 與陽性對照組比較,△P<0.05。

組別藥物變形鏈球菌遠緣鏈球菌1MBECEEP0.826±0.07194*△0.615±0.0429*△1/2MBECEEP1.112±0.07422*△0.958±0.0642*△1/4MBECEEP1.596±0.04709*1.237±0.1160*△1/8MBECEEP1.817±0.07488*△1.679±0.0992*陽性對照NaF1.451±0.05676*1.697±0.0920*陰性對照無2.011±0.02481△1.962±0.0645△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05; 與陽性對照組比較,△P<0.05。

2.2各組藥物對變形鏈球菌葡萄糖基轉移酶的影響差異在游離與生物膜2種狀態下，變形鏈球菌實驗組葡萄糖基轉移酶活性沒有受到影響，差異無統計學意義(P>0.05)；陽性對照組變形鏈球菌活性沒有受到影響，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

2.3蜂膠對變形鏈球菌屬ldh表達差異

2.3.1游離生長狀態變形鏈球菌屬ldh表達差異在游離生長狀態下，變形鏈球菌、遠緣鏈球菌各實驗組和陽性對照組乳酸脫氫酶編碼基因ldh表達均明顯受到抑制(P<0.05)。變形鏈球菌陽性對照組乳酸脫氫酶表達量高于1、1/2、1/4、1/8MIC蜂膠組，低于陰性對照組(P<0.05)。遠緣鏈球菌陽性對照組乳酸脫氫酶編碼基因ldh表達量與1、1/2、1/4MIC蜂膠組差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

組別藥物變形鏈球菌游離狀態變形鏈球菌生物膜1MICEEP0.9493±0.09751.162±0.13351/2MICEEP0.7962±0.10781.291±0.15741/4MICEEP0.8336±0.07181.248±0.22471/8MICEEP0.8337±0.14051.358±0.1431陽性對照NaF0.8947±0.12231.325±0.1403陰性對照空白0.8910±0.10531.262±0.1389

組別藥物變形鏈球菌遠緣鏈球菌1MICEEP0.136±0.0257*△0.132±0.0436*△1/2MICEEP0.253±0.0702*△0.227±0.1795*△1/4MICEEP0.378±0.0783*△0.186±0.0845*△1/8MICEEP0.470±0.2160*△0.670±0.1838*陽性對照NaF0.667±0.1168*0.369±0.1966*陰性對照無1.000±0.0608△1.000±0.0157△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05; 與陽性對照組比較,△P<0.05。

2.3.2生物膜生長狀態變形鏈球菌屬ldh基因表達差異在生物膜生長狀態下，變形鏈球菌實驗組在1、1/2、1/4MBEC濃度時乳酸脫氫酶編碼基因ldh表達明顯受到抑制(P<0.05)。遠緣鏈球菌實驗組在1、1/2、1/4、1/8MBEC濃度時乳酸脫氫酶編碼基因ldh表達明顯受到抑制(P<0.05)。變形鏈球菌、遠緣鏈球菌陽性對照組與陰性對照組相比乳酸脫氫酶編碼基因ldh表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

組別藥物變形鏈球菌遠緣鏈球菌1MBECEEP0.216±0.124*0.304±0.1014*1/2MBECEEP0.360±0.079*0.308±0.0830*1/4MBECEEP0.498±0.198*0.514±0.2113*1/8MBECEEP0.908±0.4410.670±0.1331*陽性對照NaF0.866±0.4830.695±0.6162陰性對照無1.000±0.0391.000±0.0213

注：與陰性對照組比較,*P<0.05

2.4蜂膠對變形鏈球菌gtfs基因轉錄的影響

2.4.1各組實驗藥物對游離生長狀態變形鏈球菌gtfs基因表達差異在游離生長狀態下，變形鏈球菌實驗組gtfb、gtfc、gtfd基因表達并沒有受到影響。陽性對照組gtfb基因表達增加(P<0.05)，見表7。

2.4.2實驗藥物對生物膜生長狀態變形鏈球菌gtfs基因表達差異 在生物膜生長狀態下，變形鏈球菌實驗組gtfb、gtfc、gtfd基因表達并沒有受到影響。陽性對照組gtfb基因表達增加(P<0.05)，見表8。

組別藥物gtfbgtfcgtfd1MICEEP1.202±0.26781.074±0.32961.060±0.24751/2MICEEP0.981±0.22161.008±0.10631.283±0.35721/4MICEEP1.080±0.36591.196±0.48621.186±0.35321/8MICEEP0.876±0.20071.093±0.30240.981±0.3015陽性對照NaF2.695±0.9469*0.982±0.30971.059±0.2846陰性對照無0.999±0.03111.000±0.05801.000±0.0340

注：與陰性對照組比較,*P<0.05

組別藥物gtfbgtfcgtfd1MBECEEP1.105±0.42191.117±0.38991.237±0.25661/2MBECEEP1.012±0.13521.492±0.60451.148±0.35081/4MBECEEP1.273±0.65961.332±0.59111.324±0.38241/8MBECEEP1.133±0.36931.005±0.46251.048±0.1866陽性對照NaF2.521±1.0100*1.118±0.42301.005±0.2283陰性對照無1.000±0.10241.000±0.03571.000±0.0395

注：與陰性對照組比較,*P<0.05

3討論

國內外已有學者發現蜂膠具有防齲活性，研究表明蜂膠提取物對變形鏈球菌有很強的抑制作用[4,5,10]。然而蜂膠抗微生物的作用機理較復雜，其明確的抗齲機制亦尚不明確。因此本課題組前期針對伊犁黑蜂蜂膠對口腔主要致齲菌的作用進行一系列的體外研究，發現蜂膠對游離和生物膜生長狀態變形鏈球菌屬生長、黏附、產糖和產酸等毒力因子有著不同程度的抑制活性。乳酸脫氫酶和葡萄糖基轉移酶分別在細菌糖分解代謝和糖合成代謝中起著至關重要的作用。為進一步探究不同生長狀態下伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌、遠緣鏈球菌產酸、產糖的影響機制，本研究針對蜂膠對變形鏈球菌、遠緣鏈球菌產酸、產糖代謝過程中乳酸脫氫酶和葡萄糖轉移酶的影響進行實驗研究。

3.1伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌、遠緣鏈球菌乳酸脫氫酶活性的影響本研究結果顯示，蜂膠乙醇提取物對游離生長狀態和生物膜生長狀態的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌乳酸脫氫酶活性均有顯著的抑制活性，游離生長狀態下變形鏈球菌實驗組中 1、1/2 MIC組，遠緣鏈球菌 1、1/2、1/4、1/8 MIC組；生物膜生長狀態變形鏈球菌與遠緣鏈球菌1、1/2MBEC組的抑制程度比NaF組更為明顯(P<0.05)。提示黑蜂蜂膠比氟化鈉對乳酸脫氫酶作用更為敏感。由此可推斷，伊犁黑蜂蜂膠可能通過對變形鏈球菌屬影響乳酸脫氫酶的活性，抑制細菌產酸。

國外學者Duarte等[14]發現，蜂膠提取物通過影響生物膜生長狀態變形鏈球菌耐酸關鍵酶質子移位膜三磷酸腺苷(F-ATP)酶活性抑制產酸。Jeon等[15]發現，蜂膠提取物通過對游離生長狀態變形鏈球菌細胞膜質子滲透性的作用影響細菌耐酸能力。他們認為蜂膠對變形鏈球菌產酸的影響是通過抑制細菌耐酸能力進而使細菌內環境酸化，使糖代謝途徑中相關酶活性受抑制從而降低細菌產酸能力。這與本研究結果有差異，可能是由蜂膠成分的異質性造成的。而楊清嶺等[16]體外實驗研究發現，蜂膠對變形鏈球菌乳酸脫氫酶活性有抑制作用且與藥物濃度呈正相關，此與本實驗結果一致。Pandit等[17]研究氟化物對變形鏈球菌生物膜的影響發現，氟離子在10、25、125 ppm濃度時可以抑制變形鏈球菌生物膜產酸，通過直接影響細胞膜質子通透性和抑制F-ATP酶活性對細菌耐酸產生影響。可見黑蜂蜂膠與氟化鈉的防齲機制有所差異。氟化物是目前公認的有效的防齲制劑，但其使用具有明顯的局限性，能夠使用小劑量、低毒性的天然藥物防齲作為替代也是一種不錯的選擇。在本實驗條件下，伊犁黑蜂蜂膠表現出對游離生長狀態和生物膜生長狀態變形鏈球菌、遠緣鏈球菌的乳酸脫氫酶活性及編碼基因的抑制能力，從而抑制細菌產酸。

3.2伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌葡萄糖基轉移酶活性的影響本研究結果顯示伊犁黑蜂蜂膠對游離生長狀態與生物膜生長狀態葡萄糖基轉移酶活性的影響沒有明顯差異，生物膜狀態下酶活性高于游離狀態。說明伊犁黑蜂蜂膠對GTF酶活性直接抑制作用并不明顯。有學者對蜂膠在致齲細菌細胞外多糖合成及其代謝過程中關鍵酶葡萄糖基轉移酶的影響進行了比較深入的研究。彭志慶等[18]研究發現蜂膠對變形鏈球菌的 GTF酶活性有抑制作用，隨著蜂膠濃度升高，變形鏈球菌GTF酶活性逐漸降低，當濃度達1.56 g/L時抑制作用不再增強。Hayacibara等[19]用給予標準 GTFB與 GTFC使用14C標記的蔗糖作為底物，蜂膠醇提取物作為干預措施與對照組相比較，發現蜂膠乙醇提取物可有效抑制酶活性。上述學者們用不同的實驗方法對各個地區的蜂膠進行研究發現蜂膠對變形鏈球菌的葡萄糖基轉移酶有不同程度的抑制活性。然而，也有學者實驗研究得到不同的結果，Duarte 等[14]通過研究6型巴西蜂膠對變形鏈球菌產糖、產酸以及耐酸的影響發現，6型巴西蜂膠對變形鏈球菌產酸和耐酸有明顯的抑制作用，而對細菌產糖毒力因子沒有影響，并指出6型巴西蜂膠與其他型蜂膠成分不同，其中沒有發現黃酮類物質，主要是由脂酸構成。

目前蜂膠對葡萄糖基轉移酶活性的作用仍存在爭議。產生這些不同結論的原因可能是蜂膠成分中存在對葡萄糖基轉移酶活性有直接影響的活性成分，而蜂膠的活性成分又受到地理、植物源等多種因素的影響，因此蜂膠對變形鏈球菌葡萄糖基轉移酶活性影響，研究必須結合蜂膠成分進行研究，方可發現其中的聯系。對于伊犁黑蜂蜂膠活性成分的研究目前還處于起步狀態，需要進一步研究。

3.3伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌、遠緣鏈球菌ldh基因轉錄的影響在游離生長狀態下，變形鏈球菌和遠緣鏈球菌實驗組與陽性對照組ldh基因的表達差異亦具有統計學意義。而在生物膜生長狀態下，變形鏈球菌EEP在1、1/2、1/4MBEC濃度下均可抑制ldh基因的表達，而在1/8濃度的EEP與氟化鈉對生物膜生長狀態細菌ldh表達差異無統計學意義。遠緣鏈球菌生物膜實驗組所有濃度的EEP對ldh基因表達有抑制，陽性對照組EEP對ldh基因影響與陰性對照組比較差異無統計學意義。結果提示對于2種狀態的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌，EEP的影響較氟化鈉顯著，并且EEP對游離細菌的ldh表達抑制比較生物膜生長狀態更為明顯。根據現有數據與實驗條件，變形鏈球菌與遠緣鏈球菌的MIC與MBEC濃度差異，2種細菌間表達差異無法計算。本實驗結果提示伊犁黑蜂蜂膠可能是通過對變形鏈球菌屬與變形鏈球菌屬生物膜乳酸脫氫酶ldh基因表達的調節抑制其產酸的。國內外有關蜂膠或其主要活性成分對變形鏈球菌屬ldh基因表達的研究非常少，大多研究只停留在對于酶作用的水平。而本研究通過體外實驗發現，蜂膠對變形鏈球菌、遠緣鏈球菌乳酸脫氫酶編碼基因在轉錄水平就有抑制作用，對乳酸脫氫酶活性也有抑制作用。說明伊犁黑蜂蜂膠是在酶和轉錄2個水平抑制變形鏈球菌、遠緣鏈球菌產酸能力。

3.4伊犁黑蜂蜂膠對變形鏈球菌gtfs基因轉錄的影響本實驗結果顯示蜂膠對GTF酶和其編碼基因的影響不顯著。值得一提的是，NaF對游離和生物膜生長狀態下變形鏈球菌gtfb基因的表達有上調作用。Koo等[20]體外實驗研究發現，蜂膠有效成分芹菜素可在短時間內使游離生長狀態以及生物膜生長狀態的變形鏈球菌gtfb、gtfc基因表達受到抑制，而使gtfd基因的表達增高；通過對內參照基因以及酶活性的獨立實驗證明其影響效果不受細菌活性和酶的活性的影響。其研究結果與本實驗有差異，造成這種差異的原因可能是本課題組所使用的是蜂膠乙醇提取物，而Koo等[20]所使用的實驗藥物是經過分離提純后的純物質，不會受到蜂膠中其他成分的影響。

伊犁黑蜂蜂膠作為新疆本地生產的具有良好生物學性能的天然藥物，具有其獨特的生物學特性和多方面的藥理活性，伊犁黑蜂蜂膠的毒副作用較氟化物小，具有成為新型防齲藥物的重要潛質,且采購經濟又方便，因此具有寬廣的開發應用前景。口腔的微生物環境是非常復雜的環境，其中多種微生物相互拮抗、相互協作達到動態平衡。蜂膠對多細菌菌斑的影響有待進一步研究。本實驗只對產酸與產糖代謝途徑中關鍵酶及編碼基因的轉錄水平進行了評價，而與細菌耐酸、信號傳導途徑的影響有待更深層次的研究。本實驗初步探討了蜂膠預防與治療齲病的物質基礎和藥理作用機制，為開發天然維藥防齲制劑提供了理論和實驗依據。

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(本文編輯楊晨晨)

通信作者：楊晨晨，女，在讀博士，研究方向：腫瘤的分子發生機制，E-mail：yccbys@163.com。