異丙腎上腺素對嬰兒血管瘤內皮細胞影響的體外研究

異丙腎上腺素對嬰兒血管瘤內皮細胞影響的體外研究

聶晶1， 帕提古麗·買買托合提2， 朱雅琳1

(1新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科， 烏魯木齊830054；2新疆和田地區墨玉縣人民醫院皮膚科， 新疆和田848000)

摘要：目的探討不同濃度異丙腎上腺素在體外對嬰兒血管瘤內皮細胞生長的影響及β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發病機制中的作用。方法將增殖期嬰兒血管瘤內皮細胞分為空白組(不含藥物培養基)及異丙腎上腺素低濃度組(5、10、20 mg/L)與高濃度組(50、100、200 mg/L)。藥物作用1~10 d采用MTT法分別測定各組細胞的生長曲線。結果低濃度組24~96 h對細胞生長呈現刺激作用；96 h時,低濃度組與空白對照組的吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)。而高濃度組在24~96 h對細胞生長呈現抑制作用，與空白對照相比，高濃度組細胞的吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)，并且24~96 h濃度越高，作用越強。結論β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發病中有重要作用;異丙腎上腺素對于體外培養的增殖期血管瘤內皮細胞的刺激作用與濃度相關。

關鍵詞:嬰兒血管瘤; 血管內皮細胞; 異丙腎上腺素; β-腎上腺素受體

中圖分類號：R969.4文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.010

[收稿日期：2015-02-07]

基金項目：新疆地方病分子生物學實驗室開放課題基金(XJDX0208-2011-06)

作者簡介：祖力卡爾江·阿合買提，男(維吾爾族)，碩士，研究方向：齲病學的防治研究。

The effect of isoproterenol on hemangioma endothelial cells in vitro

NIE Jing1, Patiguli Maimaituoheti2，ZHU Yalin1

(1DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830054,China;2DepartmentofDermatology,XinjiangHetian,People′sHospital,

Hetian848000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the different concentrations of isoproterenol in vitro effects on infant hemangioma endothelial cell growth and to study the function of beta adrenergic receptors in the pathogenesis of infantile hemangioma. MethodsInfantile hemangioma endothelial cells in proliferating phase were divided into three groups, the blank group (without drug culture medium), low concentration group(5, 10, 20 mg/L) of isoproterenol and high concentration group (50, 100, 200 mg/L). The growth curve of cells in each group were measured after a certain time by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) method. ResultsLow concentration group showed stimulation affection on cell growth within 24-96 hours; and in the high concentration group, cell growth were inhibited within 24-96 hours, and the hiher concentration, the stronger the effect within 24-96 hours. ConclusionBeta adrenergic receptors play an important role in the pathogenesis of infantile hemangioma;stimulation effection of isoproterenol is related with concentration of drug for in vitro culture of hemangioma endothelial cells.

Key words： infant hemangioma; endothelial; isoproterenol; beta adrenergic

血管瘤是由胚胎期血管網增生所形成。在胚胎早期，原始血管是一種單純由內皮細胞組成的管狀物，它們在間質中形成一個致密的網。隨著各器官和組織的發育，原始血管網逐漸分化成為與它們之間聯系的許多血管叢。根據原始血管內的流量和壓力，形成供應血管(動脈)或引流血管(靜脈)。體表和皮下組織的血管網易發生不規則的局部增生，日后即成為血管瘤。血管瘤是一種先天性發育異常，屬于錯構瘤性質，而非真性腫瘤，具有畸形和腫瘤的雙重特性。嬰兒血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，大多位于頭頸部，位置較表淺，也有少數發生在黏膜、肌肉、骨骼組織和內臟，不僅影響美觀，而且影響功能，甚至危及生命。目前血管瘤的發病機制尚不清楚。異丙腎上腺素屬于β-受體拮抗劑，與心得安的作用相拮抗，2008年有研究報道普萘洛爾(心得安)對血管瘤有明顯療效[1]。因此β-腎上腺素受體在血管瘤發病中的作用也越來越受到人們的關注。本研究使用不同濃度的異丙腎上腺素作用于體外培養的血管瘤內皮細胞，探討不同濃度異丙腎上腺素在體外對嬰兒血管瘤內皮細胞生長的影響及β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發病機制中的作用。

1材料與方法

1.1材料血管瘤標本來自臨床手術切除的顳部增殖期血管瘤，患兒女性，9個月。試劑： EGM-2培養基(瑞士LONZA公司)，0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)，PBS(美國HyClone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，兔抗人Ⅷ因子相關抗原一抗(武漢博士德生物公司)，兔抗人VEGFR-2一抗(武漢博士德生物公司)，HRP多聚抗兔IgG(武漢博士德生物公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物公司)。主要設備：倒置顯微鏡，酶標儀，離心機，CO2培養箱。

1.2方法

1.2.1血管瘤內皮細胞原代培養手術切除血管瘤標本立即放入1640無血清培養基儲存，并迅速移至實驗室超凈臺。血管瘤標本去上清，將標本移至無菌培養皿后，使用含雙抗PBS沖洗2遍。沖洗后更換培養皿,繼續PBS沖洗3遍。在培養皿內進行標本修剪，去除表皮、結締組織，并剪成1 mm×1 mm左右的碎塊，繼續PBS沖洗2遍。0.25%胰蛋白酶(HyClone)37℃震蕩消化3~4 h，使用含20%胎牛血清1640培養基終止消化，過濾，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，20%胎牛血清1640培養基再次重懸并離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入EGM-2(LONZA)培養基(含有血管內皮細胞生長因子、氫化考的松、抗壞血酸、人堿性成纖維細胞生長因子B、人胰島素樣生長因子、表皮生長因子)并移入25 cm2培養瓶，放入37℃ CO2培養箱。24 h后觀察細胞貼壁，換液。隨后每2~3天換液，細胞鋪滿瓶底70%~80%傳代，所有操作均在超凈臺完成，全程始終無菌操作。

1.2.2血管瘤內皮細胞鑒定

1.2.2.1Ⅷ因子相關抗原(vwf)檢測取原代培養細胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，終止后移入離心管離心(1 000 r/min，5 min)，EGM-2培養基重懸，并移入10 cm培養皿中的載玻片上，放入37℃、CO2培養箱爬片。24 h后去上清，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS沖洗3遍，加封閉液室溫30 min，PBS沖洗，加一抗兔抗人vwf多克隆抗體4℃過夜，空白對照組使用PBS作為一抗。過夜后PBS沖洗3遍，加二抗37 ℃放置30 min，DAB顯色試劑盒顯色2 min加蒸餾水終止，鏡下觀察。

1.2.2.2VEGFR-2檢測操作方法同上，一抗選擇兔抗人 VEGFR-2抗體(武漢博士德生物公司)。二抗選擇聚合HRP標記抗兔IgG，空白對照選擇PBS作為一抗，鏡下觀察。

1.3MTT法測定嬰兒血管瘤內皮細胞生長曲線取第2代細胞，均勻鋪入96孔板，每孔2×104個，加入EGM-2培養基200 μL，孵育24 h后換液。每日檢測1列8孔細胞。每日每孔加入MTT(5 mg/L)溶液20 μL，繼續培養4 h，棄上清，加150 μL DMSO，震蕩10 min。使用酶標儀(Thermo，美國)490 nm波長測每孔吸光度A，連續10 d。以時間為橫坐標，平均吸光度A為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4異丙腎上腺素對細胞生長曲線的影響

1.4.1含異丙腎上腺素培養基的配制用EGM-2培養基稀釋異丙腎上腺素，配制濃度分別為5、10、20 mg/L及50、100、200 mg/L的含有異丙腎上腺素培養基備用。所有操作均在超凈臺內完成。

1.4.2異丙腎上腺素對血管瘤內皮細胞的影響取第2代細胞消化離心并計數，然后均勻鋪入96孔板，每孔2×104個，加入EBM-2培養基200 μL，孵育24 h，細胞貼壁后換液，換為含有異丙腎上腺素的濃度分別為5、10、20 mg/L(低濃度組)及50、100、200 mg/L(高濃度組)的培養基，同時設空白EGM-2(不含異丙腎上腺素)為空白對照組。每組設4個復孔。放入CO2培養箱繼續培養。分別于24、48、72、96 h使用MTT法測定其吸光度，以時間為橫坐標，平均吸光度為縱坐標，分別做每個濃度的細胞生長曲線，并觀察細胞形態學改變。使用多個相關樣本測量的非參數檢驗比較每個濃度組及空白對照組吸光度的差異，統計軟件使用SPSS 17.0。

2結果

2.1血管瘤內皮細胞原代培養血管瘤內皮細胞原代培養24 h后觀察，逐漸貼壁，呈類圓形至多角形。生長第2~3天后，數量逐漸增多。第4~5天細胞逐漸融合，呈多角形，但數量不超過50%。第8~9天，細胞逐漸成梭形及條索形，部分部位可見有類似血管結構形成。細胞鋪滿瓶底80%以上傳代(圖1、2)。

2.2血管瘤內皮細胞鑒定

2.2.1Ⅷ因子相關抗原(vwf)檢測使用免疫組化方法染色后顯微鏡下觀察，細胞呈多角形、梭形，胞漿著色呈棕黃色，細胞核未染色，呈陽性(圖3)。

2.2.2VEGFR-2檢測使用免疫組化方法染色后顯微鏡下觀察，細胞呈多角形、梭形，胞漿著色呈棕黃色，細胞核未染色，呈陽性(圖4)。

2.3血管瘤內皮細胞生長曲線的測定使用MTT法測定血管瘤內皮細胞生長曲線，結果顯示第1~2天細胞吸光度平均值A增長緩慢，第3~5天迅速增長，第6天輕度下降，第7~8天再次上升達到平臺期，第9~10天逐漸下降(圖5)。

圖1血管瘤內皮細胞原代培養

圖2血管瘤內皮細胞第2代

圖3Ⅷ因子相關抗原免疫組化(DAB顯色×10倍)

圖4VEGFR-2免疫組織化學檢測(×10倍)

圖5　第2代血管瘤內皮細胞生長曲線(MTT法)

2.4異丙腎上腺素對血管瘤內皮細胞的影響低濃度組各組24~72 h的吸光度值無明顯差異(P>0.05)，但在96 h時發現，低濃度組與空白對照組的吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較后發現濃度越高，測得的吸光度值越高(P<0.05)，制作每組細胞吸光度的堆積折線圖(圖6)，顯示低濃度藥物對血管瘤內皮細胞具有刺激作用，并且濃度越高，其刺激作用越強。與空白對照相比，高濃度組細胞的吸光度值差異有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較后各濃度組吸光度值各不相同，濃度越高所測得細胞的吸光度值越低，提示高濃度的藥物對細胞生長呈現抑制作用，并且濃度越高，抑制作用越強(圖7)。

圖6　低濃度組異丙腎上腺素影響下血管瘤內皮細胞吸光度折線圖

圖7　高濃度組異丙腎上腺素影響下血管瘤內皮細胞吸光度折線圖

3討論

目前皮膚脈管組織腫瘤的命名很不一致，特別是血管組織腫瘤分類各不相同，迄今仍不十分滿意。1996年國際脈管性疾病研究學會將血管胎記分為兩大類：血管腫瘤和血管畸形[2]。血管腫瘤是以內皮細胞增殖為特點，包括嬰兒血管瘤、晚發性化膿性肉芽腫以及其他發生在嬰幼兒期的罕見血管瘤，而血管畸形是血管形態發生中的異常。其好發于新生兒期，與嬰兒血管瘤不同，血管畸形在出生后第1年中不迅速增長也不自發消退。而國內較為常用的是將皮膚血管瘤分為鮮紅斑痣、海綿狀血管瘤、草莓狀痣及混合型等等[3]。嬰幼兒血管瘤分為增生期、穩定期、退化期。增生期一般是指從出生后開始，一般持續6～10個月，在此期間內血管瘤不斷增生擴展，迅速向周圍皮膚及深層組織侵犯。穩定期一般持續3～6個月，此期內血管瘤增長速度逐漸緩慢，隨著幼兒生長，血管瘤緩慢增長，但增長速度仍比小兒生長快，血管瘤增生和退化交替進行。一般1歲以后血管瘤增長速度緩慢下來，部分毛細血管瘤開始退化，血管瘤內纖維脂肪組織增多，毛細血管瘤顏色從紫紅色或深紅色轉變為淡紫紅色，以后顏色逐漸變淺退變為灰色，外形由飽滿隆起轉變為扁平至皺縮，皮膚組織纖維化。

本研究選擇增生期嬰兒血管瘤為研究對象，取手術切除標本做血管瘤內皮細胞的原代培養，使用LONZA公司(瑞典)的EGM-2培養基進行培養。目前對于血管瘤發生機制的研究認為生長因子對于血管瘤的形成起到非常重要的作用，例如血管內皮生長因子及成纖維細胞生長因子、人胰島素樣生長因子等[4-6],而本研究培養基內所含有的各種生長因子能夠選擇性促進血管瘤內皮細胞的生長。因此在進行血管瘤內皮細胞原代培養時除選材為增殖期的血管瘤標本外，普通培養基不能滿足細胞生長的需要，而需要選擇含有特殊細胞因子的培養基。本研究行血管瘤內皮細胞原代培養后經鑒定為血管瘤內皮細胞。

本研究所培養的血管瘤內皮細胞生長曲線的測定也呈現第1~2天緩慢，第3~5天迅速增長，第6天輕度下降，第7~8天再次上升達到平臺期，第9~10天逐漸下降，呈現雙峰。

2008年法國Bordeaux兒童醫院Léauté-Labrèze等[1]報道，在使用心得安治療1例伴有重癥血管瘤的心肌病和另1例伴血管瘤的心輸出量增加患兒時，意外地發現血管瘤萎縮變小。隨后心得安逐漸被醫生接受并廣泛用于血管瘤患兒，取得良好的療效, 異丙腎上腺素屬于β-受體拮抗劑，與心得安的作用相拮抗，因此β-腎上腺素受體的作用受到廣泛的關注。Ji等[7]報道異丙腎上腺素在體外能夠促進血管瘤內皮細胞的生長。本研究針對異丙腎上腺素對血管瘤內皮細胞的作用展開了進一步的研究，探討不同藥物濃度對于血管瘤內皮細胞生長曲線的影響。結果顯示低濃度的異丙腎上腺素對增殖期嬰兒期血管瘤內皮細胞的生長呈現刺激作用，而高濃度(10倍)異丙腎上腺素對增殖期嬰兒期血管瘤內皮細胞的生長呈現抑制作用，提示異丙腎上腺素對增殖期嬰兒血管瘤內皮細胞的生長的影響受藥物濃度的影響。推測低濃度異丙腎上腺素對于血管瘤內皮細胞的刺激作用體現了藥物本身通過β-腎上腺素受體的作用而對血管瘤內皮細胞的促進作用，該結果與文獻[7]報道一致。而其與心得安的對血管瘤內皮細胞的抑制作用互為拮抗，呈現鏡像關系，由此推測β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤內皮細胞的發病機制中起到重要作用，而高濃度的異丙腎上腺素對增殖期血管瘤內皮細胞呈現的抑制作用機制還需要進一步的研究。

參考文獻：

[1]Léauté-Labrèze C, Dumas de la Roque E, Hubiche T, et al. Propranolol for severe hemangiomas of infancy[J]. N Engl J Med, 2008, 358(24): 2649-2651.

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[7]Ji Y, Chen SY, Li K, et al. The role of β-adrenergic receptor signaling in the proliferation of hemangioma-derived endothelial cells[J]. Cell Div, 2013, 8(1):1.

(本文編輯王艷)

通信作者：趙今，女，博士生導師，主任醫師，教授，研究方向：齲病學的防治研究,E-mail:merryljin@sina.com。