HLA-B 特異性抗原Bw4與新疆漢族鼻咽癌的相關性研究

HLA-B特異性抗原Bw4與新疆漢族鼻咽癌的相關性研究

黃莉, 王若崢

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院頭頸放療科， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討HLA-B特異性抗原Bw4與新疆漢族鼻咽癌發病的關系。方法應用聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)技術，對131例漢族鼻咽癌患者(鼻咽癌組)和168例漢族健康體檢者(對照組)進行HLA-B位點等位基因分型，確定Bw4、Bw6抗原的特異性分布，分析HLA-B攜帶Bw4對鼻咽癌患者CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群的影響。結果(1)鼻咽癌組Bw4抗原攜帶者66例(50.4%)，健康對照組Bw4抗原攜帶者120例(71.4%)，鼻咽癌組Bw4抗原表達頻率明顯低于健康對照組，兩組比較差異有統計學意義(χ2=13.869，P=0.000)。(2)鼻咽癌組CD4+T淋巴細胞水平低于健康對照組，CD8+T淋巴細胞水平高于健康對照組，兩組比較差異均有統計學意義(t=2.765，P=0.009；t=-1.768，P=0.043)。(3)鼻咽癌患者中Bw4陽性組CD4+T淋巴細胞水平高于Bw4陰性組，兩組比較差異有統計學意義(t=3.002，P=0.005)，兩組CD8+T淋巴細胞水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論Bw4抗原的缺失可能與新疆漢族鼻咽癌的發生有關，HLA-B特異性抗原Bw4對漢族鼻咽癌患者有一定的保護作用。

關鍵詞:鼻咽癌； HLA-B； Bw4； T淋巴細胞亞群

中圖分類號：R739.6文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.009

[收稿日期：2015-01-05]

基金項目：中國科學院上海巴斯德研究所/新疆醫科大學第一附屬醫院感染與免疫聯合開放實驗室種子基金(GRMY-2011-02)

作者簡介：聶晶(1983-)，女，本科，技師，研究方向：皮膚激光美容。

The association between HLA-B antigen carrying Bw4 epitope and

nasopharyngeal carcinoma among Han people in Xinjiang

HUANG Li, WANG Ruozheng

(DepartmentofHeadandNeckRadiation,theAffiliatedTumorHospitalof

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjcetiveTo investigate the relationship between human leukocyte antigen-B(HLA-B) antigen carrying Bw4 and Han people with nasopharyngeal carcinoma (NPC) in Xinjiang. MethodsPolymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) technique was employed to detect the allele frequency of HLA-B in 131 Han NPC patients and 168 normal controls. HLA-Bw genotypes were determined and their association with CD4+ T cell, CD8+T cell were analyzed. Results(1) There were 66(50.4%) cases with Bw4 in NPC, and 120(71.4%) cases with Bw4 in normal controls. The population frequency of Bw4 in NPC was lower than normal controls (χ2=13.869， P=0.000). (2)The percentage of CD4+ T cell in Han NPC was lower than normal controls (t=2.765， P=0.009) and the percentage of CD8+ T cell in Han NPC was higher than normal controls (t=-1.768， P=0.043). (3)In NPC, the group with Bw4 had higher percentage of CD4+ T cell compared with the group without Bw4 (t=3.002， P=0.005) and there was no significant differences in the percentage of CD8+ T cell between the two groups (P>0.05). ConclusionBw4 deficiency was associated with Han NPC in Xinjiang. HLA-B antigen carrying Bw4 has protective effect in Han NPC.

Key words: nasopharyngeal carcinoma; human leukocyte antigen-B (HLA-B); Bw4; T cell

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種常見的惡性腫瘤，我國是世界上發病率最高的國家之一，但南北方發病率的差異非常大，地區分布極不均衡，鼻咽癌的發病率由北到南逐漸升高，東南沿海地區尤為高發。大量的研究表明，人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA )多態性與鼻咽癌高度相關[1-3]。HLA是迄今已知基因中等位基因多態性最高的基因復合體，而HLA-B是最具多態性的HLA-I類基因，根據B位點第二外顯子C末端77~83位所編碼氨基酸序列的差異可以分為Bw4或Bw6抗原2種血清型[4]。有研究發現HLA-Bw4可能增強特異性T細胞免疫，對機體有一定的保護作用[4-5]。目前對HLA-Bw4的研究主要集中于艾滋病方面，而與鼻咽癌相關的研究甚少。本研究通過觀察Bw4抗原在鼻咽癌患者中的分布情況，檢測外周血液CD4+、CD8+T細胞水平，探索Bw4抗原在鼻咽癌發生、發展中的作用，現報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象選擇2012年1月-2014年7月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院頭頸放療科收治的病理確診的漢族鼻咽癌患者131例(鼻咽癌組)，其中男性95例，女性36例，年齡11～81歲，中位年齡45歲。所有患者入院行外周血EBV VCA-IgG檢測均為陽性。根據2002年國際抗癌聯盟(UICC) /美國癌癥聯合會(AJCC ) 分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期11例，Ⅲ期53例，Ⅳ期66例；病理類型(根據WHO分型標準)：Ⅰ型(角化性癌)1例，Ⅱ型(非角化性癌)58例，Ⅲ型(未分化癌)72例。同時選擇新疆醫科大學健康自愿獻血的漢族學生或職工為健康對照組，無鼻咽癌家族史。本研究通過新疆醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會批準，所有入組人員均簽署知情談話同意書。

1.2研究方法

1.2.1全血基因組 DNA 的提取采集外周靜脈血5 mL(EDTA抗凝)，采用北京天根生物技術有限公司的的全血基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照說明書操作進行DNA提取。應用紫外分光光度儀(Thermo Spectrophotometer-1510) 測定DNA濃度及260 nm與280 nm波長處的吸光度(A)值，A260/A280比值均為1.7～1.9，調整終濃度為0.3~0.5 μg/μL， 置于-20℃冰箱保存。

1.2.2HLA-B位點等位基因分型采用聚合酶鏈反應/序列特異性引物( polymerase chain reaction sequence specific primers，PCR-SSP) 的方法進行HLA-B位點等位基因分型。HLA分型至少采用兩位數的分辨率，由英國牛津大學HLA分型實驗室完成。

1.2.3CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群檢測采用美國Becton Dickinson公司的FACS calibur流式細胞儀，利用美國Becton Dickinson公司配套的淋巴細胞亞群檢測試劑盒(CD4/CD8/CD3 三色熒光單克隆抗體)檢測。采用BD公司的SimulSET自動分析軟件進行淋巴細胞亞群測定和分析，計算CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群所占的百分率。

2結果

2.1HLA-B位點等位基因分型及Bw4、Bw6特異性抗原分類131例鼻咽癌患者中共檢測到25種HLA-B等位基因，168例健康對照者中共檢測到23種HLA-B等位基因。根據IMGT/HLA數據庫提供的Bw4、Bw6對照表和HLA匯總表信息[6]，本研究對象共有Bw4/4純合子、Bw4/6雜合子和Bw6/6純合子3種基因型，其中鼻咽癌組Bw4/4純合子20例(15.2%)，Bw4/6雜合子46例(35.1%)，Bw6/6純合子65例(50.4%)；健康對照組Bw4/4純合子36例(21.4%)，Bw4/6雜合子84例(50.0%)，Bw6/6純合子48例(28.6%)。

2.2鼻咽癌組與健康對照組Bw4特異性抗原分布情況鼻咽癌組Bw4抗原攜帶者66例(50.4%)，健康對照組Bw4抗原攜帶者120例(71.4%)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=13.869，P=0.000，OR=0.406，95%CI：0.252~0.656)(表1)。鼻咽癌組Bw4基因頻率為32.8%(86/262)，健康對照組Bw4基因頻率為46.4%(156/336)，兩組比較差異有統計學意義(χ2=11.309，P=0.001，OR=0.564，95%CI：0.403~0.788)。

表1　鼻咽癌組與健康對照組Bw4特異性抗原分布情況/例(%)

2.3兩組中CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群測定情況研究對象中鼻咽癌初治患者32例、健康對照40例進行了外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞水平測定。鼻咽癌組外周血CD4+T淋巴細胞水平低于健康對照組，CD8+T淋巴細胞水平高于健康對照組，兩組比較差異均有統計學意義(t=2.765，P=0.009；t=-1.768，P=0.043)(表2)。32例鼻咽癌患者中Bw4/4純合子2例,Bw4/6雜合子15例,Bw6/6純合子15例，因Bw4/4純合子例數較少，故將32例患者分為Bw4陽性組(Bw4/4純合子及Bw4/6雜合子)和Bw4陰性組(Bw6/6純合子)。Bw4陽性組CD4+T淋巴細胞水平高于Bw4陰性組，兩組比較差異有統計學意義(t=3.002，P=0.005)，兩組CD8+T淋巴細胞水平比較差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表2鼻咽癌組與健康對照組CD4+、CD8+T淋巴細胞水平比較(%，)

組別nCD4+T細胞CD8+T細胞鼻咽癌組3233.897±10.13624.541±9.377健康對照組4038.652±8.70222.637±7.561t值2.765-1.768P值0.0090.043

表3鼻咽癌不同分組中CD4+、CD8+T淋巴細胞水平比較(%，)

組別nCD4+T細胞CD8+T細胞Bw4陽性組1734.269±5.45925.989±4.589Bw4陰性組1529.063±4.15822.427±6.268t值3.0021.844P值0.0050.075

3討論

鼻咽癌是一種來源于鼻咽部上皮的惡性腫瘤，其發生具有顯著的地域差異和家族聚集性特點。姚開泰和曾毅教授等提出了遺傳因素、環境因素及EB病毒共同作用的三次打擊學說來解釋鼻咽癌的發生，認為一些病例可能發生了種系突變(一次打擊)，隨后EB病毒感染可能作為“二次打擊”，在環境因素(三次打擊)的協同作用下最終發展為鼻咽癌[7]。即使中國高發區居民移居海外數年后仍有較高的發病率，提示遺傳因素對鼻咽癌的發生有重要影響[8]。

研究表明，機體抗腫瘤的效應主要以T細胞介導的細胞免疫為主，HLA與抗原多肽形成復合物，被T細胞識別，誘發特異性T細胞反應[9]。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer immunoglobulin-like receptors，KIR)是一種表達在NK細胞及部分T細胞表面的受體，通過與HLA-I類分子結合調節NK細胞和T細胞的活性，具有高度的多態性，分為抑制性受體和活化性受體，抑制性KIR與自身正常細胞表達的HLA-I類分子結合后導致NK細胞失活，從而發揮對正常細胞的保護作用，當細胞表面HLA-I類分子表達異常時，NK細胞活性不被抑制，對變異細胞進行攻擊[10]。HLA-Bw4是抑制性受體KIR3DL1的配體，而HLA-Bw6不是KIR的配體[11]。Carrington等[12]研究發現，抑制性KIR-HLA對宮頸癌的發生有保護作用，隨著NK細胞從抑制到活化，患宮頸癌的風險逐漸升高。Butsch等[13]通過病例對照研究發現，在 EBV 抗體陽性的個體中，有活化性 KIR 數目≥5的個體患鼻咽癌的風險是沒有活化性KIR個體的3.4倍。本研究通過對131例漢族鼻咽癌患者及168例健康對照進行Bw4、Bw6抗原分類，結果顯示鼻咽癌組Bw4抗原攜帶頻率明顯低于健康對照組，兩者差異有統計學意義(P=0.001，OR=0.564，95%CI：0.403~0.788)，原因可能是因為Bw4抗原缺失，無法與抑制性受體KIR3DL1結合，降低了NK細胞對正常細胞的保護作用，在EB病毒及環境因素的協同作用下，活化的NK細胞介導持續的炎癥反應導致細胞發生癌變，一定程度上Bw4 抗原缺失可能參與了鼻咽癌的發生。

Kim等[14]研究發現，在HIV感染過程中，感染結局較好的基因如HLA-B27、B51和B57等均是Bw4特異性的，而感染結局較差的基因如B8、B35等均是Bw6特異性的。Qing等[15]報道Bw4對HIV感染有一定的保護作用，而Bw6純合子與加速疾病進程相關。López等[16]提出攜帶Bw4 抗原一定程度上可以阻止HCV感染者發展至肝癌。劉珣等[5]研究發現，Bw4/4純合子HCV感染者病毒載量明顯低于Bw4/6雜合子及Bw6/6純合子，且特異性T細胞反應較強，提示Bw4抗原對HCV感染具有一定的保護作用。陳建平等[4]通過對340例HIV感染者進行CD4+T淋巴細胞檢測，發現Bw4攜帶者(Bw4/4純合子和Bw4/6雜合子)相對Bw6/6純合子具有更高的CD4+T細胞計數和更低的病毒載量。T細胞亞群在腫瘤免疫中發揮重要作用，各亞群之間的數量和比例穩定，機體才能有效地防御和抑制腫瘤，活化的CD4+T淋巴細胞能直接殺死腫瘤細胞，并對CD8+T淋巴細胞及B細胞起重要的輔助作用，而CD8+T淋巴細胞屬于抑制性T細胞，可對靶細胞產生細胞毒作用，抑制免疫反應。本研究對32例鼻咽癌患者及40例健康對照進行CD4+、CD8+T淋巴細胞檢測，結果顯示鼻咽癌組CD4+T細胞水平低于健康對照組(P<0.05)，而CD8+T細胞水平高于健康對照組(P<0.05)，提示與健康人群比較,鼻咽癌患者免疫功能受到抑制，與文獻[17-18]報道一致。同時本研究顯示鼻咽癌Bw4陽性組CD4+T淋巴細胞水平高于Bw4陰性組(P<0.05)，而兩組CD8+T淋巴細胞水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示Bw4陽性組免疫功能高于Bw4陰性組，Bw4抗原可能對鼻咽癌患者有一定的保護作用，與文獻[4]研究結果相似，但有待繼續擴大樣本量并隨訪觀察其疾病進展情況，以期Bw4能作為預測鼻咽癌疾病發展的指標之一。

參考文獻:

[1]龔哲,林志雄,胡盛平.HLA與中國南方人群鼻咽癌的相關性研究進展[J]腫瘤學雜志,2008,4(10):805-808.

[2]Lin HJ， Chering JM, Hung MS, et al. Functional assays of HLA A2-restricted epitope variant of latent membrane protein 1 (LMP-1) of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma of Southern China and Taiwan [J]. J Biomed Sci,2005,12(6):925-936.

[3]Tang M, Zeng Y, Poisson A, et al. Haplotype-dependent HLA susceptibility to nasopharyngeal carcinoma in a Southern Chinese population[J]. Genes Immun,2010,11(4):334-342.

[4]陳建平,洪坤學,賈明明,等.HLA-B寬特異性抗原Bw4與HIV-1感染者疾病進展關系的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2009,29(3):213-217.

[5]劉珣,趙艷,劉金花,等.HLA-B寬特異性抗原表位Bw4對HCV特異性T細胞反應影響分析[J].中華微生物學和免疫學雜志,2012,32(10):874-878.

[6]Holdsworth R, Hurley CK, Marsh SGE, et al. A summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5 and -DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR and -DQ antigens[J].Tissue Antigens, 2009,73:95-170.

[7]賈衛華,曾益新.鼻咽癌易感基因研究[J].腫瘤雜志,2004,19(4):270-272.

2.融資管理。企業的發展需要資金的支持，因此企業的融資是不可避免的。企業外部的融資必須要根據企業的實際發展情況以及資本結構來進行，同時需要對金融市場進行分析，制定出合理的融資方法，最終對于企業的生產經營產生促進作用。因此，企業的融資管理是企業經營過程當中的核心內容，直接關系著企業的資本運營以及經營方法，對于企業的長期發展有著非常重要的作用。

[8]Li X, Fasano R, Wang E, et al. HLA Associations with Nasopharyngeal carcinoma[J].Curr Mol Med, 2009,9(6):751-765.

[9]何維,高曉明,曹雪濤,等.醫學免疫學[M].北京:人民衛生出版社,2005:348-350.

[10]葛銳,梅揚,潘發明,等.殺傷細胞免疫球蛋白樣受體與自身免疫性疾病關聯性研究[J].中華疾病控制雜志,2010,14(1):68-71.

[11]金伯泉.自然殺傷細胞受體[J].上海免疫學雜志,1998,18(5):257-261.

[12]Carrington M, Wang S, Martin MP, et al. Hierarchy of resistance to cervical neoplasia mediated by combinations of killer immunoglobulin-like receptor and human leukocyte antigen loci[J].J Exp Med,2005,201(7):1069-1075.

[13]Butsch Kovacic M, Martin M, Gao X,et al. Variation of the killer cell immunoglobulin-like receptors and HLA-C genes in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005,14(11 Pt 1):2673-2677.

[14]Kim AY, Kuntzen T, Timm J, et al. Spontaneous control of HCV is associated with expression of HLA-B57 and preservation of targeted epitopes[J]. Gastroenterology, 2011,140(2):686-696.

[15]Qing MT, Li T, Han Y, et al.Accelerating effect of human leukocyte antigen-Bw6 homozygosity on disease progression in Chinese HIV-1-infected patients[J].J Acquir Immune Defic Syndr,2006,41(2):137-139.

[16]López-Vázquez A, Rodrigo L, Martínez-Borra J, et al.Protective effect of the HLA-Bw4I80 epitope and the killer cell immunoglobulin-like receptor 3DS1 gene against thedevelopment of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C virus infection[J].J Infect Dis, 2005,192(1):162-165.

[17]廖湘暉, 官成濃, 賴振南. 鼻咽癌放療前后T淋巴細胞亞群的檢測及臨床意義[J].廣東醫學院學報, 2014,32(3):332-333.

[18]吳偉, 劉聯斌, 周茂華. 放化療對鼻咽癌患者淋巴細胞亞群影響的觀察[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(2):129-132.

(本文編輯周芳)

通信作者：朱雅琳，女，博士，副主任醫師，研究方向：皮膚激光美容，E-mail: 294198014@qq.com。