Atp5a1基因在新疆哈薩克族食管癌中的表達(dá)分析

Atp5a1基因在新疆哈薩克族食管癌中的表達(dá)分析

張景萍1， 李卉1， 孫曉宏2， 瓦熱斯江·依不拉音2， 沙亞哈提·別爾克哈之1， 劉伊寧1，

李曉苗1， 來(lái)雯婷1， 杰別克·瓦提別克1， 美麗吾爾提·達(dá)吾列提汗1, 李惠武1

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 烏魯木齊830011;2附屬腫瘤醫(yī)院胸外科, 烏魯木齊830011)

摘要：目的利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法獲得差異表達(dá)蛋白，從中尋找與新疆哈薩克族食管癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因，為新疆哈薩克族食管癌的早期診斷和治療提供依據(jù)。方法利用二維凝膠電泳(2-dimensionelectrophoresis, 2-DE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術(shù)聯(lián)用檢測(cè)新疆哈薩克族食管癌癌組織與遠(yuǎn)端正常組織的差異表達(dá)蛋白,對(duì)其中表達(dá)上調(diào)的Atp5a1基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果2-DE結(jié)果顯示新疆哈薩克族食管癌癌組織中Atp5a1明顯可見(jiàn)，蛋白表達(dá)強(qiáng)度差異>1.5倍。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，癌組織中Atp5a1 mRNA明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Atp5a1基因的高表達(dá)和食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：ATP5a1； 比較蛋白質(zhì)組學(xué)； 食管癌

中圖分類號(hào)：R34文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.007

[收稿日期：2014-10-24]

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2011211B22)

作者簡(jiǎn)介：黃莉(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤放射治療。

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾族自治區(qū)自然科學(xué)基金(2012211A062)

作者簡(jiǎn)介：馬玉龍(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:先心病基礎(chǔ)研究。

Expression and analysis of Atp5a1 in kazakhs esophageal cancer in Xinjiang

ZHANG Jingping1， LI Hui1， SUN Xiaohong2， Waresijiang Yibulayin2， Shayahati Bieerkehazhi1，

LIU Yining1, LI Xiaomiao1, LAI Wenting1, Jiebieke Watibiekev1, Meiliwuerti Dawulietihan1, LI Huiwu1

(1BasicMedicalSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofThoracic

Surgery,TheAffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo obtain differential expression proteins of Kazakhs esophageal cancer in Xinjiang by a comparative proteomics method to find closely related gene; to provide clues for early diagnosis and therapy of occurrence and development of Kazakhs esophageal cancer Xinjiang. MethodsTwo-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were utilized for the identification of proteins differentially expressed between cancer and adjacent non-cancerous tissue. The differential expression of Atp5a1 was further verified by RT-PCR. Results2-DE results showed that kazakhs esophageal carcinoma tissue Atp5a1 clearly visible and the intensity of protein expression differences greater than 1.5 times in Xinjiang. RT-PCR validation results showed that cancer tissue Atp5a1 mRNA increased obviously, the difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionOver expression of Atp5a1 gene might be a significant function of occurrence and development of Kazakhs esophageal cancer in Xinjiang.

Key words: Atp5a1; comparative proteomics; Esophageal Cancer

食管癌是人類最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其5年生存率<15%[1]。在新疆哈薩克族居民的食管癌發(fā)病率最高，發(fā)病率高達(dá)155.9/10萬(wàn)，死亡率(88.7/10萬(wàn))遠(yuǎn)高于同地區(qū)其他民族(22.3/10萬(wàn))[2]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程是一個(gè)多階段、多種因素共同作用的結(jié)果。多數(shù)針對(duì)單個(gè)致病基因或蛋白質(zhì)的分析，不能從整體水平闡述腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。蛋白質(zhì)組學(xué)是采用高通量技術(shù)來(lái)研究疾病發(fā)生、發(fā)展全過(guò)程中整體蛋白質(zhì)水平變化的重要技術(shù)[3-5]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展，尤其是腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究已在多種腫瘤中應(yīng)用，其結(jié)果對(duì)發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)記物和為惡性腫瘤這樣難治性疾病的早期發(fā)現(xiàn)提供了廣闊的前景。目前，蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)是以雙相凝膠電泳為主的蛋白質(zhì)分離技術(shù)和以質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)為主的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)。本研究使用二維凝膠電泳(2-dimensionelectrophoresis, 2-DE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time- of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS )技術(shù)聯(lián)用檢測(cè)新疆哈薩克族食管癌患者癌組織和遠(yuǎn)端正常組織，獲得差異表達(dá)基因，擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證差異基因的表達(dá)水平，旨在為新疆哈薩克族食管癌的早期診斷和預(yù)防提供可用的分子標(biāo)記。

1材料與方法

1.1材料選取13對(duì)匹配的哈薩克族食管癌患者癌組織及相距6 cm 以上的遠(yuǎn)端無(wú)癌正常組織，所有使用樣品均來(lái)自新疆腫瘤醫(yī)院胸外科2008 年1-6 月收治的病例，均為鱗癌，提取的組織經(jīng)冷PBS 洗滌后放液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

我讀的并不是正兒八經(jīng)的中等專業(yè)學(xué)校，實(shí)際上，那只是一所職業(yè)學(xué)校。到這所學(xué)校讀書(shū)的學(xué)生，要邊學(xué)習(xí)邊到社會(huì)上打工，給剛剛成立的窮學(xué)校掙錢(qián)。聽(tīng)說(shuō)，在美國(guó)和日本，這種學(xué)校叫職業(yè)訓(xùn)練班。上這種學(xué)校的學(xué)生，要比技術(shù)學(xué)校的學(xué)生低一等。學(xué)技術(shù)和有技術(shù)的人在當(dāng)時(shí)的社會(huì)是受人尊敬的（這也是這座東北城市的傳統(tǒng)）。

1.2.12-DE選取3對(duì)匹配的哈薩克族食管癌患者癌組織及正常組織各300 mg左右，用生理鹽水清洗干凈后，在液氮中研磨粉碎，按文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行蛋白提取及定量后進(jìn)行雙向電泳。電泳上樣量為100 μg，IEF為pH3-10 非線性膠條，Amersham公司產(chǎn)品(電泳條件：30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 8 h，500 V 4 h)，SDS-PAGE為12.5%的膠(15 mA/膠 30 min，30 mA/膠 至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm)，采用AgNO3染色。

1.2.2MALDI-TOF鑒定單個(gè)蛋白質(zhì)將差異蛋白點(diǎn)，切碎后在Eppendorf管中，用Trypsin (Promega)溶液做膠內(nèi)酶解，37℃反應(yīng)過(guò)夜，Ziptip(millipore)脫鹽，具體操作按文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)選取10對(duì)匹配的哈薩克族食管癌患者癌組織及正常組織進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。采用TRIZOL 試劑一步提取細(xì)胞總RNA，RNA 提取物1 μg，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取以上樣品cDNA 2 μL，加入2×Buffer10 μL，引物各1 μL，加去離子水至20 μL，以20 μL 體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件及引物序列見(jiàn)表1。GAPDH 用于作內(nèi)對(duì)照。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結(jié)果。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，取目的基因條帶和GAPDH 條帶強(qiáng)度的比值作為目的基因的相對(duì)值。

表1　各基因的引物序列、PCR 產(chǎn)物片斷大小和PCR擴(kuò)增條件

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用IMAGEMASTERTM(GE)進(jìn)行兩組之間的t-test分析，得到合乎統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。基因差異表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1癌組織與正常組織差異表達(dá)2-DE圖譜通過(guò)2-DE技術(shù)，得到了新疆哈薩克族食管癌癌組織和遠(yuǎn)端無(wú)癌正常組織的差異表達(dá)蛋白譜。蛋白表達(dá)強(qiáng)度差異>1.5倍者, 被認(rèn)為差異蛋白, 做進(jìn)一步質(zhì)譜分析。圖1顯示Atp5a1 基因在癌組織中明顯可見(jiàn)，而正常組中未見(jiàn)蛋白。

圖1　差異表達(dá)蛋白Atp5a1局部放大圖

2.2差異蛋白的質(zhì)譜鑒定質(zhì)譜分析獲得蛋白點(diǎn)的相應(yīng)肽質(zhì)量指紋圖譜，將肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)通過(guò)因特網(wǎng)在蛋白質(zhì)序列庫(kù)中進(jìn)行搜索，在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到與其匹配的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)鑒定，該差異表達(dá)蛋白為Atp5a1(圖2)。

2.3Atp5a1基因在癌組織中高表達(dá)的RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，食管癌癌組織中Atp5a1mRNA明顯升高，癌組織中表達(dá)量為(139.92±24.86)，正常組織表達(dá)量為(72.83±19.52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048) 。結(jié)果與2-DE結(jié)果相符。電泳結(jié)果見(jiàn)圖3， 癌組織與正常組織中Atp5a1 mRNA表達(dá)量結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖2經(jīng)質(zhì)譜分析所得的肽指紋圖譜(Atp5a1)

圖3 Atp5a1 ( 403 bp)和GAPDH(298 bp)2%瓊脂糖凝膠電泳圖

a： 各樣本的表達(dá)量

b： 兩組平均值

圖4癌組織與正常組織中Atp5a1的mRNA表達(dá)量

3討論

腫瘤是一種多基因參與的復(fù)雜疾病，其發(fā)生最終都必須通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。食管癌的發(fā)病率目前已經(jīng)居全國(guó)各類惡性腫瘤第5位，而新疆哈薩克族是食管癌的高發(fā)民族，因此早期診斷及復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)是其有效治療的關(guān)鍵。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)的迅速發(fā)展，人類對(duì)疾病的研究已經(jīng)發(fā)展到了分子水平。比較蛋白組學(xué)更有助于在腫瘤組織和正常組織中檢測(cè)出候選差異蛋白分子[8-10]。本研究利用比較蛋白組學(xué)技術(shù)建立了食管癌及臨近正常組織之間的差異表達(dá)蛋白譜，選取其中有顯著意義的基因進(jìn)行mRNA水平的驗(yàn)證，并獲得了一致的結(jié)果，為尋找早期診斷指標(biāo)提供了依據(jù)，為未來(lái)哈薩克族食管癌的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療奠定基礎(chǔ)。

Atp5a1基因編碼是ATP合酶的α-亞基，ATP合酶是一個(gè)位于線粒體膜上的多亞基酶，Atp5a1基因缺失將會(huì)導(dǎo)致該酶失活，從而使細(xì)胞凋亡[11-12]。1956 年，學(xué)術(shù)界就提出假說(shuō)，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的線粒體功能損壞導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞中糖酵解速率的增加。之后的很多研究證實(shí)了該假設(shè)，并且證明在肺、肝、結(jié)腸腫瘤中，Atp5B 的表達(dá)均下降；Atp5a1在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)也減少，并且其減少可能是癌細(xì)胞獲得對(duì)5- 氟尿嘧啶抵抗力的原因[13-14]。近年，研究表明高水平的Atp5a1表達(dá)與某些SNPs和腫瘤基因P53(TP53)突變有關(guān)，高表達(dá)可加速宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)的發(fā)生，能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展；相反，低表達(dá)可能促進(jìn)基因的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (MSI)腫瘤的發(fā)展。研究顯示當(dāng)Atp5a1基因和不同的抗原提呈細(xì)胞 (APC)基因位于同一染色體上時(shí)，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在小鼠中，這2個(gè)基因都位于18號(hào)染色體上；而在人類中，Atp5a1基因在18號(hào)染色體，APC則位于染色體5q21-22上[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，癌組織中Atp5a1基因在蛋白表達(dá)水平及mRNA水平均上調(diào)。說(shuō)明在食管癌患者中，癌細(xì)胞可能正處在能量代謝旺盛的狀態(tài)，推測(cè)Atp5a1可能在新疆哈薩克組食管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。但本研究由于樣本量有限，要進(jìn)一步確定Atp5a1是否可作為新疆哈薩克族食管癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)劑，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。同時(shí)，對(duì)Atp5a1基因的確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究其與TP53和APC基因的關(guān)系，可能獲得新疆哈薩克族食管癌發(fā)生機(jī)制的重要信息。

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(本文編輯楊晨晨)

通信作者：王若崢，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤放射治療及腫瘤免疫，E-mail：wrz8526@163.com。

通信作者：李曉梅，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:冠心病基礎(chǔ)研究，E-mail:LIXM505@163.com。

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