免疫注射法建立家兔ROU模型

摘要：目的 利用實驗性家兔口腔黏膜組織勻漿加完全弗氏佐劑注射方法，免疫法建立復發性口腔潰瘍動物模型，為研究人類ROU的發病機制及治療提供理論基礎。方法 應用從實驗性家兔提取的口腔黏膜組織勻漿加完全弗氏佐劑，作為抗原免疫家兔。在家兔脊柱兩側皮內注射上述制備抗原，每2w注射一次，共12w，定期觀察家兔口腔黏膜變化及潰瘍發病情況記錄潰瘍大小及愈合情況，切取口腔黏膜潰瘍區的組織病理切片進行觀察，檢測血清中抗口腔黏膜抗體滴度驗證模型建立是否成功。結果 與空白組相比，以口腔黏膜組織勻漿+完全弗氏佐劑作為抗原的實驗組家兔都均出現ROU，潰瘍表面連續性破壞且有假膜覆蓋，上皮內有密集的淋巴細胞、單核細胞浸潤，固有層炎癥細胞大量浸潤，血清中均出現抗口腔黏膜抗體陽性。結論 利用家兔口腔黏膜組織均漿作為抗原，可引起實驗性家兔發生ROU，其臨床表現及組織學檢查均與人類ROU相似。

關鍵詞：家兔；口腔潰瘍模型；免疫

人類各種疾病的發生發展十分復雜，而動物模型的建立為深入探討疾病的發病機理及療效機理提供基礎。復發性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）又稱為復發性阿弗他潰瘍（recurrent aphthous ulcer，RAU）、復發性阿弗他口炎（re-current aphthous stomatitis，RAS），是一類慢性口腔黏膜炎癥性疾病[1]。流行病學調查顯示，其發病率高達20%左右，具有周期性、復發性及自限性等特點[2-3]。

有學者發現，用免疫熒光法研究顯示ROU基底膜熒光效應及血循環中存在抗口腔黏膜抗體，說明免疫因素是ROU發病的可能因素之一[2]。由此致病機制，通過免疫因素成功建立實驗動物ROU模型具有重要意義，為深入探討ROU的發生發展提供研究基礎。

1 實驗動物及方法

1.1實驗動物 新西蘭家兔40只，雄性，體重（2±0.2）kg，由山西醫科大學動物實驗中心提供，飼養于山西醫科大學動物實驗中心。家兔基礎飼料：山西醫科大學動物實驗中心提供。

1.2方法

1.2.1動物分組 新西蘭家兔30只，雄性，體重（2±0.2）kg，由山西醫科大學動物實驗中心提供。單籠，顆粒飼料飼養，150g/只/d，自由飲水，室溫（20±2）℃，相對平均濕度45%，實驗室適應性喂養1w。其中10只急性猝死取口腔黏膜組織備用，其余20只家兔按隨機數字表隨機分為兩組，分別為空白對照組（10只）、實驗組（10只）。

1.2.2動物模型建立

1.2.2.1抗原制備 15只家兔采用空氣栓塞法急性處死，無菌條件下，口腔黏膜下注射生理鹽水，剝取家兔口腔黏膜組織，用生理鹽水沖洗干凈，玻璃勻漿器勻漿，并加入磷酸鹽緩釋液，超聲波震蕩后將組織研磨液轉移分裝至1.5ml的離心管中，于4℃離心（14000rpm，10min），去沉淀物，將勻漿液置于-70℃低溫冰箱備用。免疫注射前，勻漿液中加入等量（等體積）費氏佐劑，振蕩器將二者充分混勻，呈乳狀液（放置不分層或者滴一滴于水面，仍保持為滴狀不散開）。

1.2.2.2動物模型建立 實驗組30只家兔3%戊巴比妥于家兔耳緣靜脈麻醉，取俯臥位，固定家兔四肢和頭部于手術架，背部剃毛并常規消毒，將抗原乳狀液注射于家兔脊柱兩側皮內，每次注射4點，每點1ml，1次/2w×6次。實驗組家兔口腔黏膜于第三次注射結束后開始出現不同程度充血。8w后陸續出現潰瘍，多集中于上唇、雙頰粘膜，潰瘍面紅腫，形態不規則，部分病損面表面可見黃白色偽膜，觸之疼痛反應明顯。

1.2.2.3組織病理學檢查 建模12w結束后，按隨機數字法，處死空白對照組、實驗組家兔各一只，3%戊巴比妥于家兔耳緣靜脈麻醉，取仰臥位，固定家兔四肢和頭部于手術架，切取對照組家兔口腔黏膜組織和實驗組家兔口腔潰瘍黏膜組織，切取組織體積大小均為5mm×5mm×2mm。無菌生理鹽水沖洗后，10%甲醛固定液固定48h，常規石蠟包埋，以8μm厚度進行黏膜組織橫斷面切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察口腔黏膜的組織變化。

1.2.2.4血清中抗口腔黏膜抗體檢測 在實驗前，第三次注射抗原后10d及結束觀察前，從實驗組及對照組家兔耳緣靜脈各采血4ml，采用補體結合試驗，以口腔黏膜勻漿作抗原，檢測血清中抗口腔黏膜抗體。

2 結果

2.1對照組家兔口腔黏膜未見明顯變化，活動正常，反應靈活，飲食正常，毛色濃密光亮。實驗組家兔口腔黏膜于第三次注射結束口腔黏膜出現不同程度充血，口唇處可見潮濕流涎，8w后陸續出現潰瘍，多集中于上唇、雙頰粘膜，潰瘍面紅腫，形態不規則，表面可見黃白色偽膜，觸之疼痛反應明顯；家兔活動量減少，反應遲緩，飲食飲水量減少。

2.2組織病理學檢查HE染色后，對照組黏膜組織切片標本顯示：黏膜上皮連續完整，固有層結締組織較致密，黏膜下層較厚可見小涎腺體。實驗組織標本切片顯示：潰瘍表面連續性破壞且有假膜覆蓋，上皮內有密集的淋巴細胞、單核細胞浸潤，固有層炎癥細胞大量浸潤，毛細血管充血擴張，血管內皮細胞腫脹，部分可見壞死區。

2.3血清中抗口腔黏膜抗體檢測 于實驗前、實驗后分別測定各組家兔血清中抗口腔黏膜抗體效價，對照組實驗前后、實驗組實驗前均未檢測到抗口腔黏膜抗體，實驗組實驗后血清中檢測到抗口腔黏膜抗體。

3 討論

本實驗選用新西蘭家兔作為理想的整體動物模型。近年來報道，建立ROU動物模型的方法有很多，包括化學燒灼法、自身組織抗原免疫注射法、組織剪切創傷法、氧自由基誘導法、細菌感染誘導法、放射法等。其中自身組織抗原免疫注射法所建模型的臨床及病理表現與復發性口腔潰瘍最接近，且組織學檢查均表現為非特異性炎癥。

4 結論

本實驗采用新西蘭家兔作為實驗動物，用健康同種異體家兔口腔黏膜組織勻漿加完全費氏佐劑作抗原于家兔脊柱兩側行皮內注射，引起實驗家兔發生ROU，其病損與人類ROU相比，臨床及組織學檢查較為相似，因此可以作為人類ROU的動物模型，為進一步研究人類ROU的病因和治療提供基本手段和實驗依據[4]。

參考文獻：

[1]Scully C，Porter S.Oral mucosal disease：recurrent aphthous stomatitis[J].British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery，2008，46（3）：198-206.

[2]陳謙明，主編.口腔粘膜病學[M].北京：人民衛生出版社，2010.

[3]Chavan M，Jain H，Diwan N，et al.Recurrent aphthous stomatitis：a review[J].Journal of Oral PathologyMedicine，2012，41（8）：577-583.

[4]陶學金，李明，逢愛慧，等.免疫方法建立復發性口腔潰瘍動物模型[J].臨床口腔醫學雜志，2004，20（1）：53-54.編輯/哈濤