細菌性應急檢驗實效性的提高方法探討

摘要：目的 研究如何提高細菌性突發事件的病因診斷實效性。方法 采集某次食物中毒事件中重點樣品，使用聚合酶鏈反應（PCR）雙色熒光檢測試劑對樣品進行檢測。結果 本次細菌性應急檢驗中16h出病因初步診斷結果，40h出階段檢驗結果，48h出最終診斷結果。結論 細菌性突發事件應急檢驗中，采用PCR方法可在較短的時間內診斷出結果，能夠有效提高細菌性病因應急檢驗的實效性。

關鍵詞：細菌性應急檢驗；實效性；聚合酶鏈反應

Abstract：Objective To study how to improve the effectiveness of the etiological diagnosis of bacterial emergencies.Methods The samples were collected on a food poisoning incident，the use of the polymerase chain reaction（PCR）detection of dual color fluorescence detection reagent for sample.Results The bacterial emergency inspection 16 hours out of the initial diagnosis of etiology，40 hour stage test results，48 hours out of the final diagnosis results.Conclusion The bacterial emergency inspection，using the method of PCR can be obtained in a short period of time to diagnosis，can effectively improve the effectiveness of bacterial etiology of emergency test.

Key words：Bacterial emergency inspection；Effectiveness；Polymerase chain reaction

面對水質污染、食物中毒、傳染病等細菌性污染事件，需要及時診斷并提高檢驗的實效性。在細菌性污染事件中，快速而準確地鑒定細菌種類是提高細菌性污染事件處理效率的關鍵[1]，但傳統的細菌培養鑒定方法所需時間較長，不符合政府要求的快而準的時效性。本研究以某次食物中毒事件為例，探討提高細菌性應急檢驗實效性的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集某次食物中毒事件中的重點樣品，包括32份食物中毒患者肛拭子，9份飲用水水樣，10份食物，11份廚工肛拭子，2份冰箱拭子。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器 使用儀器包括熒光定量PCR儀、半自動細菌生化鑒定儀、電熱恒溫培養箱、生物顯微鏡及微生物過濾系統；試劑：PCR雙色熒光檢測試劑（由深圳生科院技術有限公司生產），各種增菌液、生化反應管和選擇性培養基（北京陸橋技術有限公司生產）。

1.2.2檢測方法 根據檢驗需求，接到標本后，采用一種或多種PCR試劑盒對標準同時處理，肛拭子直接劃線接種各種選擇性分離平板，置入肉湯中，進行37℃增菌培養，對飲用水樣品通過微生物過濾系統進行抽濾、食物樣品均質處理，然后再行增菌培養。6h后取出增菌液100μl，離心5min，棄上清液，加入100μl生理鹽水，離心2min，棄上清液，加20μl裂解緩沖液，并置100℃金屬浴，10min后再次離心2min，保留上清液備用；食物樣品加入少量生理鹽水中，混合均勻后，離心10min，取上清液高速離心5min，加20μl裂解緩沖液，后續處理同增菌液。按照試劑盒要求，將反應液分組混合均勻，按照22μl進行分裝，取經處理后的各類標本上清液3μl加入反應液，并取參比品3μl加入相應的反應液中，同時上機行PCR擴增循環，收集熒光信號，判斷結果。

2 結果

2.1提前純培養并鑒定 有9份樣品在直接劃平板培養9h后，長出疑似沙門菌的菌群。將這些可以菌群提前進行半固體瓊脂斜面、三糖鐵瓊脂斜面、蛋白胨水、賴氨酸脫羧酶試驗培養基、尿素瓊脂、蛋白胨水的接種，并置于37℃進行純培養。挑選出提示為半固體瓊脂斜面培養6h后的純培養物，行API生化鑒定及血清凝集試驗。接到樣品后16h，根據血清試驗和PCR檢測的結果，初步判斷食物中毒的致病因子為沙門氏菌。

2.2生化鑒定結果 分離平板20h之后，培養出典型沙門氏菌群。接到樣品后40h，結合血清學試驗、鏡檢菌體形態、和生化反應的結果，并經API生化鑒定試劑盒鑒定，確定結果為腸炎沙門氏菌。

2.3最終結果 根據對不同批次的培養物穿插培養和鑒定試驗的結果，接到樣本后48h內，陸續檢出腸炎沙門氏菌的樣品患者肛拭子23份、廚工肛拭子7份、冰箱拭子l份。結合流行病學的調查，最終確定為腸炎沙門氏菌感染。

3 討論

近年來，我國發生的微生物細菌中毒事件逐漸上升，細菌性食物中毒是較為常見的微生物食物中毒[2]。傳統的細菌培養鑒定方法主要是通過樣品分布增菌，增加病原的可檢出率。以檢測有害微生物而言，測定菌群總數的標準方法是在無菌情況下，將待測樣品稀釋，取2～3種適宜的稀釋度，將1ml的每種稀釋度大測樣品放入15ml培養基的滅菌平皿中在（36±1）°溫箱中培養（48±2）h，取出計算平皿中菌落數，再乘以稀釋倍數，即得每克或每毫升樣品中所含的菌落總數。實驗的過程中，還需要做出平行樣品并作空白對照。這種方法培養的時間較長，且對檢測人員的工作經驗和專業水平以及檢測條件要求比較嚴格[3]。

目前，許多新的快速檢測正在迅速發展，如比色DNA雜交檢測法、基因探針法聚合酶鏈反應法（PCR）等分子生物學方法；此外還有抗阻法等生物化學法，其中PCR是上世紀80年代中期發展起來的的一種用于放大擴增特定的DNA片段的體外核酸擴增技術，具有快速便捷、特異度及敏感度高、易自動化等多個優點，可同時檢驗兩種細菌，節省時間，大大提高了檢測的效率[4-5]。此次病因診斷，16h出初步診斷結果，報告階段檢驗結果的時間為接樣后40h，在接樣后48h出最后診斷結果。根據這個診斷結果，表明在細菌性病因應急檢驗中應用PCR方法可有效提高縮短細菌鑒定時間，提高檢驗的實效性。檢測過程中，應嚴格做好PCR檢測儀的質量控制，分清楚出現的假陽性和假陰性，將它的檢驗結果與培養結果結合判斷，并作為結果進行報告。

綜上，對于細菌性突發事件，檢驗人員應充分認識到應急檢驗實效性的重要作用，以最快的速度和準確的結果報告初步結果，分階段報告檢驗結果和最終結果。充分利用流行病學的調查，不拘泥于傳統的檢驗方法，利用快速檢驗設備及試劑作出快速檢驗。對重點樣品進行可疑菌種的重點監測，提高診斷的效率。

參考文獻：

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[2]金晶，殷愛芹，徐子茗，等.細菌性食物中毒檢測臨床意義[J].中外健康文摘，2010，7（8）：108-108.

[3]宋寧生.細菌性食物中毒檢驗技術探討[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34（B12）：51-53.

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[5]黃薇，趙翔，唐曉旻，等.核酸檢測技術在細菌性食源疾病檢測中的應用探討[J].現代預防醫學，2011，38（2）：344-347.

編輯/哈濤