COX—2及VEGF在大鼠腦出血損傷過程中作用及其機(jī)制的研究

摘要：目的 探討大鼠ICH后缺血腦組織中VEGF和COX-2含量變化與神經(jīng)功能損傷之間的關(guān)系。方法 采用自體動(dòng)脈血注射法制備ICH大鼠模型，采用RT-PCR和Elisa試驗(yàn)方法，檢測(cè)出血性損傷后6h、12h、24h和72h時(shí)腦組織中VEGF和COX-2蛋白及其mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 VEGF蛋白及mRNA于出血性損傷12h后開始增加，24h達(dá)到峰值，隨后開始減少；COX-2及mRNA的含量變化出現(xiàn)時(shí)間較早，損傷6h候后含量開始逐步增加，于24h到達(dá)峰值，隨后逐漸減少。結(jié)論 在大鼠腦出血損傷過程中，VEGF 蛋白和mRNA 的表達(dá)增加，與腦出血后微循環(huán)的重建有關(guān)，并對(duì)出血腦組織具有保護(hù)和促進(jìn)功能恢復(fù)的作用；COX-2的表達(dá)強(qiáng)弱與腦組織的損傷程度密切相關(guān)，廣泛的參與出血性腦損傷的病理生理過程。

關(guān)鍵詞：腦出血、VEGF、COX-2

本試驗(yàn)采用自體動(dòng)脈血注射法制備ICH大鼠模型，研究大鼠ICH后缺血腦組織中VEGF和COX-2含量變化與神經(jīng)功能損傷之間的關(guān)系，探討VEGF和COX-2在ICH過程中的具體作用機(jī)制，為臨床治療ICH進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康Wistar大鼠36只，由佳木斯大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥品與試劑 VEGF和COX-2酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司； TRIzol試劑盒、DL2000 DNA Maker和RT-PCR一步法試劑盒購(gòu)于大連寶生物有限公司；VEGF和COX-2 引物委托上海生物工程公司合成。

1.3模型制作及分組 參照陳小平[1]的方法，采用自體動(dòng)脈血回注尾狀核建立ICH大鼠模型。10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉動(dòng)物后，俯臥位固定于立體定位儀上，頭頂部做正中切口，調(diào)整定位儀使大鼠前囟和后囟處于同一平面，以前囟中央為原點(diǎn)，于前囟前0.2 mm，中線向右旁開3.5mm 處鉆一直徑為1 mm的小孔，微量進(jìn)樣器沿鉆孔進(jìn)針，深度為5mm，即尾狀核位置，模型組大鼠被緩慢注入50μl 自體動(dòng)脈血；假手術(shù)組注入50 ul生理鹽水，15～20 min注射完畢，留針5 min后緩慢將針退出，縫合皮膚。動(dòng)物蘇醒后按Bederson[2]神經(jīng)損傷評(píng)分法去除0級(jí)和4級(jí)，隨機(jī)將符合要求的動(dòng)物分成4組，于術(shù)后6h，12h，24h和72h后處死取尾狀核附近腦組織進(jìn)行檢測(cè)，分別標(biāo)記為B、C、D、E組，另取健康大鼠10只做為正常對(duì)照組，即A組。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 按照TRIzol試劑說明書嚴(yán)格操作，提取腦組織中總RNA，使用RT-PCR一步法試劑盒檢測(cè)腦組織中VEGF和COX-2 mRNA的表達(dá)變化。

反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液10ul，dNTP混合物（10mM） 10ul；AMV RTase（5U/ul） 2ul；RNase Inhibitor （40U/ul） 2ul；AMV oplimized Taq（5U/ul） 2ul；Mg2+（25mM） 20ul；上、下游引物（10 pmol/μL）各2ul；提取總RNA 2ul；RNase free 水48ul。反應(yīng)條件：①45℃反轉(zhuǎn)錄 15min；②94℃預(yù)變性2min；③94℃變性30sec；④退火30sec；⑤72℃延伸90sec；⑥步驟③④⑤重復(fù)30個(gè)循環(huán)；⑦72℃終末延伸10min。其中退火溫度VEGF為52℃，COX-2為54℃，β-肌動(dòng)蛋白為55℃。

擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳，UVP成像系統(tǒng)拍攝，圖像分析軟件對(duì)電泳所得條帶灰度半定量分析。

1.5 Elisa檢測(cè) 按照試劑盒操作說明書，采用雙抗體夾心法對(duì)大鼠腦組織中VEGF和COX-2含進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)450nm下測(cè)定吸光度值OD，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得腦組織中VEGF和COX-2含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，所得數(shù)值用x ±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織內(nèi)VEGF和COX-2含量變化 VEGF的檢測(cè)結(jié)果，腦組織出血損傷后6h內(nèi)，VEGF的含量與正常組相比無明顯變化，隨著時(shí)間的推移12h開始增加，24h達(dá)到峰值，隨后開始減少，但72h仍維持較高水平。損傷腦組織內(nèi)COX-2的含量變化出現(xiàn)時(shí)間較早，損傷6h候后含量開始增加，于24h到達(dá)峰值，隨后逐漸減少。

2.2各組大鼠腦組織內(nèi)VEGF和COX-2 mRNA表達(dá)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果，在495bp和488bp附近有擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度吻合。掃描圖像吸光度數(shù)值經(jīng)過方差分析顯示，模型組腦組織內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)在6h內(nèi)與正常組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異，P>0.05，12h時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)，24h到達(dá)峰值，隨后表達(dá)逐步趨于減弱，72h仍明顯高于正常水平，P<0.05；COX-2 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)明顯早于VEGF，6h既有明顯的增加，24h達(dá)到峰值，隨后開始減弱，但72h時(shí)表達(dá)仍明顯高于正常值，P<0.05。

3討論

VEGF是一種與機(jī)體組織損傷后新血管生成密切相關(guān)的一種細(xì)胞因子，已有試驗(yàn)證實(shí)，在腦組織出血性損傷后，其表達(dá)明顯增強(qiáng)。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述結(jié)論相一致，通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，試驗(yàn)大鼠腦出血12h后，損傷部位腦組織內(nèi)的VEGF蛋白及其mRNA的表達(dá)同步增強(qiáng)，于24h達(dá)到表達(dá)峰值，表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)與蘇建和揣蘭香[5-6]等人的研究結(jié)果吻合。Lee研究結(jié)果指出，試驗(yàn)性腦出血大鼠損傷部位腦組織內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)，能夠促進(jìn)損傷部位生成新的血管，可以對(duì)神經(jīng)元的功能恢復(fù)提供豐富的營(yíng)養(yǎng)供給，Jin還指出VEGF對(duì)神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，降低皮質(zhì)神經(jīng)元在低氧和低糖狀態(tài)下的損傷，提高神經(jīng)元抵御應(yīng)激性傷害的能力，延長(zhǎng)存活時(shí)間。VEGF表達(dá)增強(qiáng)后與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF 受體相結(jié)，從而激活一系列的缺血傳導(dǎo)通路， 誘導(dǎo)新生血管的生成，保證缺血腦組織微循環(huán)的重新建立。因此，本試驗(yàn)結(jié)果VEGF 蛋白和mRNA 的表達(dá)增加，提示可能與腦出血后微循環(huán)的重建有關(guān)，是缺血腦組織急性期抗損傷機(jī)制的體現(xiàn)。

COX-2是催化花生四烯酸合成各種前列腺素的關(guān)鍵酶，廣泛的參與機(jī)體許多病理生理過程，很多研究報(bào)道顯示，COX-2在出血性腦損傷過程中扮演著中藥的角色。主要與一下幾點(diǎn)密切關(guān)聯(lián)：①通過NO介導(dǎo)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷；②高濃度COX-2可使興奮性氨基酸毒性和破壞性增加；③COX-2刺激氧化自由基的產(chǎn)生，引起神經(jīng)元DNA氧化損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；④引起腦組織缺血性損傷后血腫周圍水腫。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，缺血性損傷6h COX-2表達(dá)即開始增強(qiáng)，說明COX-2參與了腦組織的出血性損傷的初始過程，并且隨著損傷時(shí)間的推移而變化，本研究發(fā)現(xiàn)出血性損傷24h后COX-2表達(dá)最高，許多研究顯示，腦組織出血性損傷的最嚴(yán)重階段為出血后24h，說明COX-2的表達(dá)強(qiáng)弱與腦組織的損傷程度密切相關(guān)，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳小平，李小剛. COX-2 在大鼠腦出血損傷機(jī)制中的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志， 2008，11（5）：70-73

[2] 王愛岳，李強(qiáng)，周治平.1 HIF- 1α、VEGF 在高血壓腦出血灶周的表達(dá)和意義[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39（10）：2524-2526編輯/成森