套式反轉錄—聚合酶鏈反應nested—RT—PCR與直接免疫熒光DFA用于檢測臨床鼻病毒human rhinovirus HRV基因的效果對比分析

摘要：目的 對比分析套式反轉錄-聚合酶鏈反應（nested-RT-PCR）與直接免疫熒光（DFA）用于檢測臨床鼻病毒（human rhinovirus，HRV）基因的效果。方法 選擇320例急性下呼吸道感染患兒作為研究對象，將其對積分為對照組和觀察組，分別使用套式反轉錄-聚合酶鏈反應（nested-RT-PCR）與直接免疫熒光（DFA）檢測兩組患兒深部鼻咽分泌物（nasopharyngeal secretion，NPS）的臨床鼻病毒（human rhinovirus，HRV）基因，比較兩種方法的檢測結果。結果 套式nested-RT-PCR診斷HRV病毒具有快速、簡單、操作方便、檢出率高且特異性強的特點，值得臨床推廣使用。

關鍵詞：鼻病毒；急性下呼吸道感染；套式nested-RT-PCR；直接免疫熒光

人鼻病毒（HRV）是最常見的引起人類病毒性呼吸道感染的病原體，大約有50%以上的普通感冒是由該病毒硬氣的。同時，HRV還是加重哮喘的重要原因，大約70%左右的學齡前兒童的哮喘加重和HRV感染密切相關。套式反轉錄-聚合酶鏈反應（nested-RT-PCR）是目前檢測HRV的一種生物學技術，其具有敏感性高、快速、方便等特點，本研究則主要是對套式反轉錄-聚合酶鏈反應（nested-RT-PCR）與直接免疫熒光（DFA）用于檢測臨床鼻病毒（human rhinovirus，HRV）基因的效果進行對比分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年1月～9月在我院接受治療的確診為小兒急性下呼吸道感染（ALRTI）患兒320例作為研究對象，將其隨機分為對照組和觀察組，每組160例，采集所有患兒的NPS標本進行HRV檢測，其中對照組使用DFA進行檢測，觀察組使用套式nested-RT-PCR進行檢測。患兒年齡1～15歲，平均（7.2±1.8）歲，男239例，女81例，診斷為肺炎278例，毛細支氣管炎6例，急性支氣管炎10例，喘息性支氣管炎26例。兩組患兒在年齡、性別等方面差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 采集所有患兒的深部NPS加入生理鹽水置于無菌收集管中，放置與-70℃的低溫冰箱保存。分別使用套式nested-RT-PCR與DFA檢測深部NPS標本中的HRV基因。套式nested-RT-PCR操作步驟為：首先進行病毒RNA的提取，然后通過逆轉錄合成cDNA，然后進行套式聚合酶鏈反應，電泳后觀察檢測結果。DFA操作步驟：首先用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進行稀釋，然后低滴加適當的熒光標記物，在使用PBS沖洗、浸泡，然后滴加緩沖甘油，用熒光顯微鏡觀察標本的特異性熒光強度。

1.3統計學分析 對記錄所得數據使用SPSS18.0軟件進行統計學分析，計量資料使用（x±s）表示，組間比較進行t檢驗；計數資料使用百分率表示，組間比較進行χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

兩組患兒HRV檢出率和檢測時間比較具體見表1。

根據表1可知，使用套式式nested-RT-PCR檢測的陽性率為33.75%，使用DFA方法檢測的陽性率為7.5%，兩組陽性率比較具有顯著差異（P<0.05），提示套式nested-RT-PCR檢測方法陽性檢出率顯著DFA。

3 討論

HRV是最常見的導致普通感冒在內的呼吸道感染的原因，越來越多的研究吧表明HRV是引起小兒呼吸道感染的重要病原體之一[1]。HRV的感染以小年齡的兒童為主，具有明顯的季節分布特征，在3～5月為最高峰，HRV感染的檢出率根據檢測方法的不同而不同，傳統的病毒培養檢測兒童肺炎的HRV，陽性率約為3%～10%，而采用套式nested-RT-PCR檢測HRV的檢出率有了提高，大約在30%左右。

本研究中使用深部NPS標本進行病毒的分離、抗原檢測和套式nested-RT-PCR檢測，能夠準確地鑒定LRI病毒病原。套式nested-RT-PCR檢測HRV具有快速、敏感、特異性強的特點，監測的可靠性高[2，3]。DFA則是將熒光標記在相關抗體上，直接與相應的抗原反應。該種加測方法操作簡便、特異性高、廉價、有效，商品化的免疫熒光檢測試劑對常見的呼吸道病毒進行檢測的診斷方法經過了WHO的審評，結果可靠，但缺點是敏感性較低，每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體，而且其在檢測HRV方面不能將其優勢顯現出來[4，5]。本研究結果顯示：使用套式式nested-RT-PCR檢測的陽性率為33.75%，使用DFA方法檢測的陽性率為7.5%，兩組陽性率比較具有顯著差異（P<0.05）。

綜上所述，套式nested-RT-PCR診斷HRV病毒具有快速、簡單、操作方便、檢出率高且特異性強的特點，值得臨床推廣使用。

參考文獻：

[1]王春，趙百惠，張泓，等.上海市兒童下呼吸道感染常見病毒診斷方法比較[J].檢驗醫學，2011，（09）：112-115.

[2]吳栩.熒光定量PCR檢測呼吸道標本中的人偏肺病毒[D].浙江大學，2010.

[3]吳栩，汪夭林，陳志敏，等.熒光定量聚合酶鏈反應方法檢測呼吸道標本人偏肺病毒臨床研究[J].中國實用兒科雜志，2012，（08）：332-334.

[4]狂犬病病毒熒光定量PT-PCR檢測試劑盒的研制與應用[D].吉林大學，2011.

[5]李安，崔言順，沈志強，等.新型反轉錄、復合套式聚合酶鏈式反應（RT-nPCR）鑒別豬瘟強毒和弱毒疫苗方法的建立[J].中國獸醫學報，2011，（01）：78-81.

編輯/哈濤