山羊糞便總DNA提取方法的比較

李 霞，陳新諾，王 蕾，姚 梅，劉芳田，岳 華

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

近年來，腸道微生物菌群對動物機體的健康和疾病的影響越來越受到人們的關注[1]。從DNA分子水平診斷山羊細菌感染和帶菌情況是目前臨床診斷的發(fā)展趨勢。因此，對臨床標本中細菌DNA提取方法的優(yōu)化顯得尤為重要；同時，提取細菌DNA對于宿主本身的基因測序及疾病診斷也很重要。從糞便中提取總DNA不僅方便，且提取的DNA種類繁多，如果提取的總DNA片段完整性好，濃度、純度高，那么用于后續(xù)實驗則方便快捷。目前，從糞便標本中提取DNA的方法眾多，但由于提取機理和步驟的差別，同時又由于宿主不同，所獲得的DNA濃度、純度和完整性就各不相同，導致在后續(xù)實驗（如PCR擴增、DNA測序和限制性核酸內(nèi)切酶的分析等）中的應用效果不同[2]。

關于山羊糞便中細菌DNA提取方法的研究，之前尚未見報道，本實驗在提取山羊糞便中細菌DNA的基礎上，提取山羊糞便總DNA，以探索出最適于提取山羊糞便總DNA的方法，為后續(xù)實驗提供基礎材料。現(xiàn)將試驗結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 主要試劑 磷酸鹽緩沖液（PBS），TE緩沖液，十二烷基硫酸鈉（SDS），酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），氯仿∶異戊醇（24∶1），無水乙醇，5mol/L NaCl，十六烷基-三甲基-溴化銨（CTAB），溶菌酶，蛋白酶 K，DNA Marker，天根試劑盒，OMEGA試劑盒。

1.2 主要儀器 恒溫水浴鍋、高速離心機、漩渦振蕩儀、加熱爐、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白檢測儀。

1.3 糞便樣本的收集與預處理 直接采集山羊新鮮糞便于15mL滅菌EP管中，-20℃保存，待提取總DNA用。預處理：稱取3g糞便樣本，置于15mL EP管中，搗碎混勻，加 18 mL PBS緩沖液（pH 7.4），放入搖床過夜。取出過夜處理的糞便樣本，渦旋混勻3～5min，3000r/min 離心 3min，取上清。重復以上步驟3次。取上清分裝成6份，每份1.5mL，裝入1.5mL EP管，12000r/min離心10min，棄上清。

1.4 四種方法提取細菌DNA

1.4.1 酚-氯仿抽提法。將所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶，混勻后37℃水浴1h，加65μL蛋白酶K和65μL 10%SDS，混勻后37℃水浴2h。然后再用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提 1 次，4℃、12000r/min離心10min后取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），4℃、12000r/min離心 10min后取上清，然后用2倍無水乙醇沉淀DNA，4℃、12000r/min離心5min取上清，最后用70%乙醇洗滌沉淀，干燥后將DNA沉淀溶于50 μL TE緩沖液中，-20℃保存。

1.4.2 CTAB法。將所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶，混勻后37℃水浴1 h，加入30 μL蛋白酶K和30μL 10%SDS，37℃水浴2h，然后再加入100μL 5mol/L NaCl和 80μL CTAB/NaCl，65℃水浴 10min。水浴結束后再用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，最后將DNA沉淀溶于50μL TE，-20℃保存。

1.4.3 天根試劑盒法。按照試劑盒要求操作，最后將所得DNA溶液于-20℃保存。

1.4.4 OMEGA試劑盒法。按照試劑盒要求操作，最后將所得DNA溶液于-20℃保存。

將以上4種方法提取的DNA均取4 μL上樣在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)進行成像，判斷DNA完整性。

2 結果

2.1 DNA電泳檢測結果 從圖1可見，酚-氯仿抽提法和CTAB法提取的DNA電泳條帶較明亮，但有嚴重的拖尾現(xiàn)象，說明酚-氯仿法和CTAB法提取的DNA濃度較高，但都降解成了大量的小片段。天根試劑盒法和OMEGA試劑盒法抽提的糞便DNA全是均勻的抹帶，說明這兩個試劑盒抽提的DNA完整性好，且天根試劑盒法的抹帶比OMEGA試劑盒法的亮，說明天根試劑盒法提取的DNA濃度更高。

圖1 四種方法提取的糞便DNA電泳圖譜

2.2 DNA含量和純度的檢測 由表1可以看出，酚-氯仿抽提法和CTAB法提取出的糞便總DNA含量較高，而天根試劑盒法和OMEGA試劑盒法提取的糞便總DNA含量偏低。OD260/OD280反映了DNA的純度，正常情況下OD260/OD280值約為1.7～2.0，若OD260/OD280值小于1.7或大于2.0，說明可能有蛋白質(zhì)污染或RNA污染[3]。酚-氯仿抽提法和OMEGA試劑盒法提取DNA的OD260/OD280值均大于2.0，說明存在RNA污染。CTAB法和天根試劑盒法提取DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0內(nèi)，說明天根試劑盒法和CTAB法提取的DNA純度較高。

表1 糞便樣品中的DNA含量和OD260/OD280值（n=3）

3 分析

關于糞便中提取細菌總DNA的方法，目前的報道雖然較多，但由于其提取機理和步驟的差異，所獲得的DNA含量和純度也各不相同，導致在后續(xù)實驗（如PCR擴增、DNA測序等）過程中的結果差異很大[4]。本實驗比較了四種從糞便標本中提取總DNA的方法，得到了可用于后續(xù)實驗的DNA模板。

基因組DNA提取的理想方法，首先要考慮到DNA的純度和濃度，這是分子生物學研究的基礎[5]，其次要考慮到DNA的得率，即提取率，要盡可能減少DNA的降解[6]。本實驗提取的是山羊糞便總DNA，所以提取DNA的完整性很重要。通過對四種提取方法的比較，我們發(fā)現(xiàn)天根試劑盒法提取的糞便總DNA雖然濃度較低，但純度高，完整性好，能為后續(xù)實驗提供完整的DNA片段。本次實驗預處理過程中將加PBS的糞便樣本放入搖床過夜，目的是使糞便充分溶解以保障抽提到高質(zhì)量的DNA。

4 結論

四種方法均能提取出DNA，傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法經(jīng)濟可靠，但提取的DNA完整性不好，且純度低。CTAB法提取的DNA濃度和純度都較高，但大量降解。天根試劑盒法提取的DNA雖然濃度低，但操作方便簡單，時間短，純度高，完整性好，質(zhì)量穩(wěn)定。OMEGA試劑盒法提取的DNA完整性好，但純度和濃度都較低。綜合考慮，推薦使用天根試劑盒法作為提取山羊糞便總DNA的方法。

[1]Nicholson J K， Holmes E， Wilson I D.Gut microorganisms，mammalian metabolism and personalized health care[J].Nature Reviews Microbiology，2005，3（5）:431-438.

[2]陳蓓，黃瑞.糞便標本中細菌DNA提取方法的比較[J].中國血液流變學雜志，2007，17（2）:210-212.

[3]吳銀寶，史金才，莫測輝，等.豬糞和土壤樣品中微生物DNA提取方法的比較[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2006，22（增刊 2）:10-13.

[4]陶新，徐子偉，鄧波，等.少量動物糞便細菌總DNA提取方法的研究[J].中國畜牧雜志，2009，45（23）:68-70.

[5]張寧，王鳳山.DNA提取方法進展[J].中國海洋藥物，2004，25（2）:40-46.

[6]Chen H，Rangasamy M，Tan SY，et al.Evaluation of five methods for total DNA extraction from western corn rootworm beetles[J].PLoS One，2010，5（8）:1-6.