上皮鈣黏素/連環素復合體對大鼠神經干細胞增殖作用的影響

上皮鈣黏素/連環素復合體對大鼠神經干細胞增殖作用的影響

顏建輝1黃麗娟1楊柳1陳雁斌1華力明1

(湘南學院心腦血管研究所，湖南長沙410000)

摘要〔〕目的探討E-鈣黏素/連環素(E-cadherin/catenin)復合體對神經干細胞(NSCs)增殖作用的影響。方法從胎鼠腦組織中分離、培養NSCs，制備細胞懸液，隨機分為正常組、實驗1組、實驗2組。克隆大鼠E-cadherin全長于慢病毒(Lentivirus)，轉染至實驗1組NSCs；采用siRNA法將E-cadherin對應片段克隆進入Lentivirus載體，轉染至實驗2組。RT-PCR及Western印跡方法檢測各組細胞E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表達水平。以MTT法繪制細胞生長曲線，免疫熒光染色標記計數Nestin、BrdU 陽性細胞數目。結果實驗1組E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表達水平均顯著高于正常組，但NSCs增長率及BrdU 陽性細胞數目顯著低于正常組(P<0.05)；實驗2組E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表達水平顯著低于正常組，但NSCs增長率及Nestin、BrdU 陽性細胞數目均顯著高于正常組(P<0.05)。結論下調E-cadherin/catenin復合體的表達可能促進體外培養的NSCs增殖。

關鍵詞〔〕E-鈣黏素/連環素；神經干細胞；慢病毒

中圖分類號〔〕R-36〔文獻標識碼〕A〔

1湘南學院附屬醫院

第一作者：顏建輝(1974-)，男，副教授，副主任醫師，主要從事腦血管病變研究。

神經干細胞(NSCs)是一類具有分化為神經元細胞，并能夠提供大量腦組織細胞能力的干細胞，因NSCs的自我更新、多向分化潛能的性質，被譽為“萬能細胞”，在中樞神經系統受損的多種疾病中都有重要的治療價值。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種重要的細胞間黏附分子，參與形成和維護正常細胞間的連接〔1〕。E-cadherin功能的發揮離不開連環素(catenin)的作用，它可以與α-catenin、β-catenin、γ-catenin及p120-catenin一起組成E-cadherin/catenin 復合體，在維持上皮細胞的組織結構完整性和新陳代謝過程中起到重要作用。p120ctn是穩定E-cadherin/catenin復合體的主要成分，最新研究表明，E-cadherin與p120-catenin結合，可以調控人胚胎干細胞的微環境以及重編程功能〔2〕。在小鼠的胚胎干細胞中研究發現，E-cadherin/β-catenin介導細胞與細胞間的黏附，同時可以抑制GSK-3β活性，調控干細胞的自我更新活性〔3〕。但是，E-cadherin/catenin復合體對NSCs的增殖作用鮮有報道。本課題觀察E-cadherin/catenin復合體內黏附分子變化對移植NSCs的增殖的影響，為提高NSCs移植治療相關疾病的臨床療效及新藥的開發提供實驗依據。

1材料與方法

1.1動物孕14 d Wistar大鼠1只，由武漢大學動物實驗中心提供。

1.2主要試劑多聚賴氨酸、巢蛋白(nestin)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)、Lipofectamine 2000均由Sigma公司提供； B27復合物、胎牛血清、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)由北京中杉金橋試劑有限公司提供； DMEM/F12基礎培養基、Trizol試劑盒、RNA 抽提試劑盒、熒光標記FITC試劑、DAB顯色劑、SABC免疫組化試劑盒均由武漢子心生物科技有限公司提供；兔抗山羊IgG-Cy3，山羊抗鼠IgG-FITC均由武漢博士德生物有限公司提供；E-cadherin單克隆抗體及p120-catenin抗體均由Abcam公司提供；Lentivirus病毒由上海吉滿生物科技公司提供。

1.3方法

1.3.1NSCs的分離與培養取孕14 d Wistar大鼠，脫臼處死后于無菌條件下取出胎鼠，取出大腦組織D-Hank漂洗后，剪碎，吹打分散制成細胞懸液，離心，棄上清，置于含有2%B27，20 μg/L bFGF的DMEM/F12培養基中，在CO2培養箱中懸浮培養，3 d后待克隆球形成后，換液，用同樣的方法傳代培養3～4次，收集懸浮神經球制備單細胞懸液，調整濃度至1×105/ml。

1.3.2實驗分組將上述NSCs單細胞懸液等分為3份，分別為正常組、實驗1組及實驗2組。正常組不作任何處理，繼續培養。

1.3.3E-cadherin克隆及過表達 克隆大鼠E-cadherin編碼序列全長，表達于Lentivirus病毒載體，經293T細胞包裝后，收集病毒，轉染至實驗2組的NSCs，具體轉染步驟按Lipofectamine 2000試劑說明書操作。

1.3.4siRNA-Lentivirus病毒載體構建及轉染根據siRNA的設計原則,使用Invitrogen公司siRNA設計軟件，載體pGenesil-的酶切位點以及GenBank中大鼠E-cadherin(GenBank accession AB017696.1)的編碼序列，設計并合成片段如下：siRNA：5'-AAGATAGGAGTTCTCTGATGC-3' 陰性序列：5'-GGCGUGUCUCUCUUACGAC-3'。序列采用慢病毒(Lentivirus)載體，將對應片段克隆進入載體，經293T細胞包裝后，收集病毒，轉染至實驗1組的NSCs，操作同上。

1.4MTT法測定NSCs的生長曲線取上述各組NSCs懸液，以無血清培養基接種于96孔培養板(細胞濃度1×104個)，150 μl/孔，觀察記錄細胞的生長狀況，在每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，培養4h，手機孔內細胞并離心，每孔加入150 μlDMSO，震蕩10 min，并分別于1、2、3、4、5、6和7 d以酶標儀自動測定490 nm波長時OD值。

1.5RT-PCR檢測E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn 的mRNA的表達Trizol提取總RNA，反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板行PCR 擴增，各基因的引物序列，見表1。PCR 產物以2%瓊脂糖凝膠電泳測定擴增帶灰度值，得到mRNA的相對表達量，以β-actin為參照。

表1各基因引物序列及擴增片段長度

基因引物序列(5'→3')擴增片段長度(bp)E-cadherin正義鏈:TGCCCCAGTATCGTCCCCGT186反義鏈:CGGTTGCCCCATTCGT-TCAGATAAp120-ctn正義鏈:TGCCCTGCTGGATTTGTCTT250反義鏈:CGCTGGGTGTCCTGATGTGCβ-catenin正義鏈:GACTCTGAGAAACTTGTC-CGATGC375反義鏈:CGCTGGGTGTCCTGATGTGCβ-actin正義鏈:GAAATCGTGCGTGACATTAAG665反義鏈:CTAGAAGCATTTGCGGTGGA

1.6Western印跡法檢測E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的蛋白表達各組NSCs懸液，裂解、變性后離心，取上清液，以Bradford測定總蛋白量。取10 μg蛋白上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳后，轉印至PVDF膜；然后將膜室溫下封閉2 h，PBS漂洗，分別加入一抗E-cadherin(1∶400)、β-catenin(1∶200)及p120-ctn(1∶400) ，4℃過夜；辣根過氧化物酶標記二抗37℃孵育1 h，ECL發光顯色，以圖像分析系統觀察表達情況，以β-actin作為對照。

1.7Nestin、BrdU免疫熒光染色及計數各組NSCs接種于無菌蓋玻片的24孔培養板中(預先包被0.01%多聚賴氨酸)，于37℃，5%CO2培養箱中培養，收集貼壁細胞制備細胞爬片，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，加一抗Nestin(1∶200)、BrdU(1∶200)進行免疫熒光染色，隨機觀察100個視野，熒光顯微鏡下計數每個視野的陽性細胞數，并取其平均值。

2結果

2.1各組E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的表達Western印跡和RT-PCR法顯示，實驗1組E-cadherin蛋白及mRNA表達較正常組則顯著增強(P<0.05)，呈過表達狀態，β-catenin 及p120-ctn蛋白及mRNA表達也顯著增強(P<0.05)；而經過siRNA干擾后，實驗2組的E-cadherin的蛋白及mRNA表達均較正常組顯著減弱，差異均有統計學意義(P<0.05)，β-catenin 及p120-ctn的蛋白及mRNA表達較正常組也顯著減弱(P<0.05)，見圖1，圖2。

A、B、C：正常組、實驗2組及實驗1組，下圖同 圖1　E-cadherin、β-catenin及p120-ctn的蛋白表達

圖2　E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的mRNA表達

2.2各組NSCs的生長曲線實驗1組的OD值與正常組相比顯著降低(P<0.05)，而實驗2組的OD值則顯著高于正常組及實驗1組(P<0.05)，見圖3。

圖3　各組NSCs的生長情況

2.3免疫熒光測定各組Nestin及BrdU陽性細胞數目BrdU 熒光染色陽性細胞胞質著紅色，Nestin染色陽性細胞則呈綠色；與正常組相比，實驗1組的Nestin及BrdU陽性細胞數目顯著減少(P<0.05)，而實驗2組的Nestin及BrdU陽性細胞數目則顯著高于正常組及實驗1組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2及圖4，圖5。

組別Nestin陽性細胞BrdU陽性細胞正常組43.28±12.4532.15±10.64實驗1組20.07±9.131)14.22±8.931)實驗2組72.63±13.011)2)61.37±11.061)2)

與正常組比較：1)P<0.01；與實驗1組比較：2)P<0.01

正常組　　　　　　實驗1組　　　　　　實驗2組 圖4　BrdU陽性細胞數目(免疫熒光×400)

正常組　　　　　　實驗1組　　　　　　實驗2組 圖5　Nestin陽性細胞數目(免疫熒光,×400)

3討論

NSCs能夠生成神經組織，在體外能維持未分化狀態，因其具有多向分化潛能和自我更新能力〔4，5〕，故而NSCs移植為腦損傷修復以及神經性疾病的治療帶來了希望。近年來，隨著人們對影響NSCs增殖的不斷深入研究，發現微環境對于干細胞的自我更新，增殖，分化調控以及干細胞遷移和歸巢至關重要，而微環境中E-cadherin是其中重要組成部分。研究發現E-cadherin介導的細胞與細胞間連接，可以促進小鼠胚胎干細胞自我更新，且不依賴LIF因子，這表明E-cadherin在干細胞的自我更新中扮演關鍵性角色〔6〕。catenin是一類位于細胞質內結構相似的糖蛋白家族,也是E-cadherin最為密切的細胞質內黏附相關蛋白配體，E-cadherin黏附功能的正常發揮，主要受catenin的調節。該家族中主要包括α-catenin、β-catenin、γ-catenin及p120-catenin。當胞質內α-catenin將β-catenin和(或)γ-catenin與細胞骨架的肌動蛋白微絲相連，而β-catenin和(或)γ-catenin

直接與E-cadherin 的胞質區結合，即形成了E-cadherin/ catenin 復合體。該復合體能將E-cadherin定位于細胞與細胞間的接觸部位，在細胞間黏附、建立細胞極性、維持組織形態中起重要作用。P120ctn 是穩定E-cadherin/catenin復合體的主要成分〔7〕。大量研究表明，腫瘤組織中如果E-cadherin/catenin復合體出現破壞或丟失的現象,細胞間黏附將會丟失，有利于惡性細胞的無限制增生〔8〕。而上皮細胞內E-cadherin過度表達能抑制細胞的游走與增殖，誘導細胞凋亡〔9〕。因此，推測如果下調E-cadherin/catenin復合體的表達，可能會促進體外培養NSCs的增殖。

本實驗結果提示隨著E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn表達的下降，導致E-cadherin與catenin連接受阻，E-cadherin/catenin復合體與細胞骨架相互作用減弱，使E-cadherin不能定位于膜上，被胞質內蛋白酶降解，細胞的黏附功能障礙，細胞間連接松散，黏附力下降，有利于傳遞增殖信號導，細胞分裂增殖能力增強，從而促進了NSCs的增殖。

綜上所述，下調E-cadherin/catenin復合體的表達可能促進體外培養的NSCs增殖，為NSCs治療中樞神經系統疾病提供了新的視點，但是其具體作用機制尚需要更深入的研究。

4參考文獻

1Zhang L，Ju X，Cheng Y，etal.Identifying Tmem59 related gene regulatory network of mouse neural stem cell from a compendium of expression profiles〔J〕.BMC Syst Biol,2011；29(5):152.

2Li D，Zhou J，Wang L，etal.Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions〔J〕.J Cell Biol,2010；191:631-44.

3Sineva GS，Pospelov VA.Inhibition of GSK3beta enhances both adhesive and signalling activities of beta-catenin in mouse embryonic stem cells〔J〕.Biol Cell,2010；102:549-60.

4Hong BH，Ha S，Joo Y，etal.Amyloid precursor protein binding protein-1 knockdown reduces neuronal differentiation in fetal neural stem cells〔J〕.Neuroreport,2012；23(2):61-6.

5Crockett S，Clarke M，Reeves S，etal.Cystine glutamate exchanger upregulation by retinoic acid induces neuroprotection in neural stem cells〔J〕.Neuroreport,2011；22(12):598-602.

6Soncin F，Mohamet L，Eckardt D，etal.Abrogation of E-cadherin-mediated cell-cell contact in mouse embryonic stem cells results in reversible LIF-independent self-renewal〔J〕.Stem Cell,2009；27(9)：2069-80.

7Berx G，van Roy F.Involvement of members of the cadherin super-family in cancer〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol,2009；1(6):a003129.

8Brooks SA，Lomax Browne HJ,Carter TM ，etal.Molecular interact ions in cancer cell metastasis〔J〕.Acta Histochemica,2010；112(1):3-25.

9趙遠,王永忠.上皮鈣粘蛋白和β-連環蛋白的研究進展〔J〕.江蘇醫藥,2011；37(13):1581-4.

〔2013-12-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)