缺氧損傷模型中胰島素樣生長因子-1對少突膠質前體細胞自噬和增殖能力的影響

缺氧損傷模型中胰島素樣生長因子-1對少突膠質前體細胞自噬和增殖能力的影響

劉洋許婧1周韜1陳松伊超馬春杰沈雷2

(齊齊哈爾醫學院第二附屬醫院神經外科，黑龍江齊齊哈爾161006)

摘要〔〕目的探討胰島素樣生長因子(IGF)-1對缺氧性少突膠質前體細胞損傷的修復機制。方法分離提純Wistar大鼠少突膠質前體細胞，設立正常對照組、缺氧組、缺氧IGF-1組，MTT法觀察細胞增殖，Western印跡法檢測LC-3蛋白表達。結果分離提純的細胞符合少突膠質前體細胞鑒定標準；缺氧IGF-1組細胞增殖OD值比缺氧組提高1.3倍(P<0.05)；缺氧IGF-1組少突膠質前體細胞LC-3的表達逐漸上升，90 min后呈逐漸降低的趨勢。結論IGF-1通過增加保護性自噬機制，促進少突膠質前體細胞的增殖，對修復神經損傷具有重要意義。

關鍵詞〔〕少突膠質前體細胞；胰島素樣生長因子-1；自噬；缺氧

中圖分類號〔〕R74〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：齊齊哈爾市科學技術計劃社會發展項目(No.SFGG-201230)

1齊齊哈爾醫學院2013級實驗班

2齊齊哈爾醫學院解剖教研室

第一作者：劉洋(1975-)，男，副主任醫師，主要從事神經外科醫療研究。

腦白質中數量最多的少突膠質細胞對缺氧損傷比較敏感〔1〕，缺氧等是導致少突膠質細胞損傷而產生腦白質病變的主要因素〔2〕。近年來研究〔3〕發現，中樞神經系統中廣泛分布著少突膠質細胞前體細胞(OPC)，在體外培養OPC具有自我更新增殖和不對稱分化的能力，說明OPC是具有干細胞或干細胞樣特性的細胞，是少突膠質細胞的前體類神經干細胞。所以，少突膠質細胞的損傷有可能通過促進OPC的分化而達到逆轉腦白質病變的作用。胰島素樣生長因子(IGF)-1對神經干細胞生長具有促進作用〔4〕，但是關于IGF-1對OPC的作用研究比較少。深入闡述缺氧模型條件下IGF-1對OPC的增殖、自噬和凋亡的影響，可以為探尋以OPC為靶點治療腦缺氧缺血性疾病的方法提供研究基礎。

1材料與方法

1.1OPC的培養動物實驗獲得齊齊哈爾醫學院倫理委員會同意。按文獻〔5〕記載的方法培養出生72 h內Wistar 大鼠(齊齊哈爾醫學院動物實驗中心)的腦組織中OPC。

1.1.1膠質混合細胞的培養按照Armstrong〔6〕的細胞培養流程。取0～3日齡Wistar大鼠幼崽，斷頭處死，取除去小腦的全腦組織，并置于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中。除去內層和外層腦膜后，依次通過尼龍網孔眼為125 μm和36 μm的細胞篩，900 r/min，離心10 min，把細胞懸液重懸于5 ml膠質混合培養基〔按1∶1比例混合DMEM培養基和F12培養基(均購自美國Gibco公司)，并添加10%胎牛血清(美國Gibco公司)，100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素(碧云天，杭州)〕。將得到的懸浮液接種在細胞培養瓶，37℃，5%CO2培養。

1.1.2OPC分離培養〔7〕在細胞培養箱中，以180 r/min速度搖動細胞培3 h后，用0.01 mol/L PBS溶液洗滌1次，然后添加新鮮的膠質混合培養基，再繼續搖晃18 h后，將上清液按1 700 r/min速度離心5 min，種植在涂布著5 μg/ml聚-L-賴氨酸的培養皿內，37℃，5%CO2培養45 min；取上清液，以1 000 r/min轉速離心5 min，再重懸于1 ml膠質混合培養基中，37℃，5%CO2培養。

1.2少突膠質細胞的鑒定取純化培養10 d的OPC細胞，4%多聚甲醛室溫固定 20 min；10%山羊血清封閉 50 min；滴加兔抗大鼠A2B5抗體(1∶300，Santa Cruz，美國)，4℃過夜；次日滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔IgG(1∶200，Santa Cruz，美國)，37℃避光1 h；二氨基聯苯胺(DAB)底物緩沖液(DAKO)水溶性封片液封片；熒光顯微鏡下觀察。

1.3缺氧模型制作以及實驗分組用含10 mmol/L Na2S2O4(四川科龍，成都)的膠質混合培養基培養OPC，建立缺氧模型〔4〕，或在缺氧細胞模型中添加100 mmol/L IGF-1(Sigma，美國)，分為正常對照組、缺氧組、缺氧IGF-1組。2×104細胞貼壁后30、60、90 min為觀察點。

1.4MTT細胞增殖實驗按少突膠質前體細胞分組情況，1×104細胞/孔，37℃，5%CO2培養48 h，每孔加入噻唑藍(MTT)(20 μl，5 mg/ml，Sigma)，37℃，5%CO2孵育4 h，更換二甲基亞砜(DMSO)(150 μl，Sigma)，使用Emax酶標儀(Molecular Devices)，490 nm波長測定每個樣品吸光度(OD值)。

1.5Western印跡法檢測少突膠質前體細胞中自噬標記蛋白(LC)-3表達使用多能干細胞(IPs)細胞裂解液(碧云天生物公司，福州)裂解細胞，并提取各組細胞的總蛋白；凝膠電泳；將蛋白質轉膜到硝酸纖維素膜(Millipore,美國)，5%牛血清白蛋白(Santa Cruz，美國)封閉2 h，在4℃條件下，兔抗鼠LC-3(1∶200，Santa Cruz，美國)孵育12 h，然后以山羊抗兔IgG(1∶150,Santa Cruz，美國)和超敏化學發光法(ECL)試劑盒(碧云天生物公司，福州)進行免疫印跡分析，β-actin為上樣對照。IPP軟件分析圖像光密度值差異。

1.6統計學方法采用SPSS18.0軟件進行t檢驗或方差分析。

2結果

2.1OPC的培養和鑒定分離OPC胞體較大，呈卵圓形團狀生長，伸出1～2個長突起，向四周發散，細胞增殖不明顯；分離培養的OPC A2B5抗體染色陽性。見圖1。

2.2IGF-1對OPC增殖的影響缺氧組細胞增殖OD值較正常組降低(P<0.05)；而缺氧IGF-1組細胞增殖OD值比缺氧組提高1.3倍(P<0.05)。見表1。

2.3LC-3表達結果缺氧IGF-1組OPC從培養時，LC-3的表達逐漸上升，60 min達高峰，90 min呈現降低趨勢；缺氧組和缺氧IGF-1組各時間點LC-3比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖 2，表2。

藍色：DAPI標記；綠色：FITC標記A2B5抗體 圖1　A2B5在少突膠質前體細胞的表達(標尺=150 μm)

組別30min60min90min正常組0.553±0.2780.981±0.1230.854±0.210缺氧組0.301±0.9591)0.712±0.3471)0.623±0.3211)缺氧IGF-1組0.456±0.2702)0.926±0.9832)0.795±0.1902)

與正常組比較：1)P<0.05，與缺氧組比較：2)P<0.05

圖2　Western印跡法檢測缺氧組和缺氧 IGF-1組不同時間點LC-3表達變化

組別30min60min90min缺氧組0.523±0.0750.468±0.0850.610±0.046缺氧IGF-1組0.312±0.0411)0.937±0.0631)0.783±0.0621)

與缺氧組比較：1)P<0.05

3討論

腦室周圍白質軟化癥(PVL)是老年人好發的腦白質病，危害患者生命和家庭幸福〔8〕。目前認為，缺氧缺血是導致中樞神經系統損傷的主要原因〔9〕。腦白質中含有大量少突膠質細胞、小膠質細胞等膠質類細胞，其中少突膠質細胞對缺氧損傷最為敏感〔10〕，因此認為缺氧導致的腦白質疾病可能是通過損傷少突膠質細胞而引起的〔2〕。OPC屬于多能干細胞，在體外一定誘導因素的作用下，OPC分化成星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元的潛能，對神經系統損傷修復將會發揮具有重要作用。

OPC會分化產生成熟的少突膠質細胞，是中樞神經系統發育過程中形成軸突髓鞘的主要成分，如果少突膠質細胞病變損傷就會發生中樞神經系統脫髓鞘疾病。本文培養的細胞體積不大，由開始的雙極細胞形，逐漸在胞體周圍出現細小突起，隨著培養時間的延長，細胞突起逐漸增多，并成2、3級分支，相鄰的細胞之間突起相連，形成接觸面(點)，在外觀上符合OPC的形態特點。研究認為，OPC的鑒定除了形態指標外，還可以使用免疫染色、定量實時PCR或Western印跡等技術檢測OPC表面A2B5、NG2等特異性抗體進行標記鑒定〔11〕。也有科學家通過miRNA技術下調少突膠質細胞標志物A2B5、NG2〔12〕，抑制OPC分化而確定OPC的培養結果。本文通過免疫組織化學的方法熒光標記證明培養的細胞屬于OPC，與其他學者研究一致，也為進一步實驗奠定了實驗基礎。

目前已知神經營養因子(NGF)、腦源性神經生長因子(BDNF)、白血病抑制因子(LIF)等許多生長因子均參與或維持OPC的增殖與存活〔13〕。其中血小板源性生長因子(PDGF)-α、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)〔14〕、神經生長因子(NT)-3〔15〕和IGF-1〔16〕等4種多肽因子與OPC的增殖密切相關。

IGF-1屬于IGF家族的成員〔17〕，是神經系統發育的重要調控因子，在中樞神經系統發育和分化中具有重要作用；IGF-1具有減少損傷神經元死亡、促進突起生長和突觸形成的作用〔18〕。IGF-1是體內少突膠質前體細胞生長需要的重要生長因子，IGF-1參與中樞神經系統損傷后，對神經元的再生和修復過程〔19〕。本實驗尚發現，在缺氧條件下，使用IGF-1刺激OPC可以促進該細胞增殖，也驗證了IGF-1是能夠促進OPC增殖的營養因子。本實驗認為，對于老年性腦白質疾病，有可能通過使用IGF-1通過刺激OPC可以促進該細胞增殖，逆轉老年腦白質脫髓鞘性疾病的癥狀。

自噬參與去除、回收多余的或損壞的細胞器和細胞質，是細胞生存、分化、發育和維持內環境動態平衡至關重要的現象〔20〕。本實驗觀察到，缺氧條件下，IGF-1刺激的OPC自噬現象明顯，而凋亡呈現降低變化，這可能是由于OPC在IGF-1影響下，分泌NGF、VEGF等細胞因子〔21〕，BDNF 與其特異性受體TrK B結合通過Ras能激活PI3K途徑〔22〕，激活的PI3K可改變質膜小葉內磷脂肌醇的構成，進一步導致Akt 蛋白激酶 B 易位到質膜，激活PI3K/Akt/mTOR通路這一調節自噬的經典途徑〔23〕。激活的保護性自噬行為，可以防止線粒體等細胞器氧化損傷〔24〕。細胞自噬表達升高，降解因為缺氧而引起的結構或功能異常的細胞，產生的氨基酸或ATP可以被其他細胞繼續利用，這種自噬現象是生物進化形成的保護機制〔25〕。說明IGF-1促進OPC的增殖有可能通過增加自噬途徑而實現，當然，相關的機制研究還需要深入探討。

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其次，在雙創教育師資團隊建設方面，學校應積極重視打造一支由學校骨干教師和企業專家組成的優秀創新創業導師隊伍。由于來自“學院派”的校內導師缺乏在企工作經歷和項目合作案例，導師隊伍結構中來自校外背景的人員應多些。校外導師的聘用途徑包括：一是從已畢業的往屆優秀校友中選擇一批擁有成功創業歷程和經驗的；二是與當地政府和創業產業園區合作，甄選出社會責任感強的、經營管理經驗豐富的企業專家。

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〔2014-03-12修回〕

(編輯袁左鳴)