細胞外信號調節激酶1/2對糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬區Bax表達的調控作用

細胞外信號調節激酶1/2對糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬區Bax表達的調控作用

李建民周娜趙雅寧薛承景陳長香張盼李淑杏

(河北聯合大學康復醫學院神經研究所，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探討細胞外信號調節激酶1/2對糖尿病腦缺血再灌注大鼠海馬區Bax表達的調控。方法采用鏈脲佐菌素誘導聯合改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法制作糖尿病全腦缺血再灌注模型，并應用ERK1/2抑制劑U0126對糖尿病腦缺血再灌注大鼠預處理。分別在缺血1、6、24和48 h應用光鏡觀察海馬區神經細胞形態變化；免疫組織化學法檢測磷酸化ERK1/2和Bax表達水平。結果糖尿病腦缺血組各時間存活神經元密度顯著低于血糖正常腦缺血組、磷酸化ERK1/2表達水平低于血糖正常腦缺血組、Bax表達水平高于血糖正常腦缺血組；應用U0126處理后，各時間點海馬區神經元細胞存活密度降低、磷酸化ERK1/2表達降低、Bax表達增高。結論ERK1/2活化通過介導Bax表達參與并介導了糖尿病加重全腦缺血再灌注后神經細胞的丟失。

關鍵詞〔〕細胞外信號調節激酶1/2；糖尿病;腦缺血再灌注；Bax；海馬區

中圖分類號〔〕R743.31〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省自然科學基金 (H2012401007)；河北省衛生廳課題(20110527)

通訊作者：趙雅寧(1974-)，女，副教授，博士，主要從事神經病學研究。

第一作者：李建民(1962-)，男，教授，博士，主要從事神經病學研究。

研究表明高血糖能加重腦缺血所致的各種腦損傷，是腦缺血發病率和死亡率增高的重要的獨立危險因素〔1，2〕， 糖尿病患者腦卒中發病率明顯高于非糖尿病患者，且腦損害的嚴重程度、腦卒中死亡的可能性均增加，預后較差〔3〕。但糖尿病加重腦缺血損傷的機制尚未明確。細胞外信號調節激酶1/2 (ERK1/2)是有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族重要組成部分，活化后經多級激酶的級聯反應把細胞外刺激信號向細胞內傳遞，至細胞核中，激活下游的激酶或多種轉錄因子從而介導細胞產生各種生物學反應，在細胞增殖、分化及凋亡等的過程中具有至關重要的作用。目前ERK1/2在腦損傷疾病的作用尚存在爭議。本研究應用糖尿病聯合腦缺血再灌注模型，觀察實驗大鼠海馬區磷酸化ERK1/2和Bax表達變化以及神經細胞丟失情況，并應用ERK1/2通路抑制劑U0126進行處理，探討ERK1/2在糖尿病加重腦缺血再灌注神經元損傷中的作用及對Bax的調控作用。

1材料和方法

1.1實驗動物及試劑本實驗共用健康雄性SD大鼠80只，由北京維通利華實驗動物中心提供；多克隆磷酸化ERK1/2和Bax免疫組化試劑盒購自中杉生物有限公司(北京)。

1.2動物分組和處理80只雄性SD大鼠〔SCXK(京)2005-0013〕，體質量(185±19)g,隨機分為假手術組(SO)和血糖正常全腦缺血再灌注組(NI/R)和糖尿病全腦缺血再灌注組(DCI)和DCI +ERK1/2抑制劑U0126干預組；每組又隨機平均分為缺血再灌注1、6、24和48 h時間亞組。

1.3分別作如下處理SO組：分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈；NI/R組：采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法〔4〕制作大鼠全腦缺血模型：動物常規麻醉，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，在其下置線備用。枕后部正中切開,暴露雙側第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間約2～4 s，使翼小孔后雙側椎動脈永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠，24 h后以無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，缺血30 min后松開動脈夾，實行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監測耳內鼓膜溫度，并使之維持在(37±0.2)℃。DCI組：大鼠術前禁食12 h，按55 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，72 h后空腹血糖超過16.7 mmol/L，有多尿、體質量下降等表現的大鼠為糖尿病造模成功。然后按上述全腦缺血模型進行手術，制作糖尿病+全腦缺血再灌注模型。DCI+ERK1/2抑制劑U0126干預組：預先將U0126用二甲基亞砜溶解，于動物在制作形成糖尿病模型后再完成腦缺血再灌注模型前30 min經尾靜脈注射(0.01 mg/kg)。

1.4病理組織學檢測各組動物在規定時間點以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛經左心室灌注固定后取腦,在視交叉后1～6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4 %多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)，進行HE染色。在有測微尺的光學顯微鏡(200×)下觀察海馬區神經元形態變化并計數(200×)倍視野下的神經細胞數，即神經元密度(ND)，取均值。

1.5磷酸化ERK1/2和Bax蛋白免疫組化切片常規脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，分別滴加磷酸化ERK1/2和Bax抗體(ERK1/2：1∶200；Bax：1∶150)， 濕盒中4℃過夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV 二步法)，37℃溫箱 30 min，DAB 顯色，脫水、透明、封片。以 PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片，陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，200倍光鏡下每張切片在海馬隨機選取4個視野，在有測微尺的光學顯微鏡(200×)下觀察海馬區陽性細胞變化并計數(200×)倍視野下的陽性細胞數量。

2結果

2.1形態學結果SO組海馬區神經元排列緊密，神經元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰，胞質著色淺而均勻。NI/R 組海馬區細胞輪廓模糊，排列紊亂，胞體收縮呈多角形或不規則，部分胞質自溶；各時間點存活神經元密度均明顯減少(P<0.05)；DCI 組中海馬區神經元結構損傷加重，大部分胞質自溶，各時間點神經元細胞存活密度進一步降低(P<0.05)；U0126組神經細胞結構損傷明顯，存活神經細胞數量較DCI明顯減少(P<0.05)。表1。

2.2磷酸化ERK1/2和Bax免疫組化結果磷酸化ERK1/2陽性表達主要位于細胞核，少量位于細胞質，陽性細胞的胞核或胞質內可見細小的棕黃色顆粒(圖1)。SO組可見少量磷酸化ERK1/2陽性細胞，染色淺淡。與SO組比較，NI/R 組1 h和6 h時間點磷酸化ERK1/2陽性細胞增多，24 h和48 h迅速下降但顯著高于SO(P<0.05)；與NI/R組比較，DCI組各時間點磷酸化ERK1/2陽性細胞減少(P<0.05)；U0126組各時間點磷酸化ERK1/2陽性細胞較DCI明顯減少(P<0.05)。Bax：Bax陽性表達主要位于細胞質，陽性細胞的胞質可見細小的棕黃色顆粒(圖2)。SO組偶見Bax陽性細胞，染色淺淡。與SO組比較，NI/R 組各時間點Bax陽性細胞均增多(P<0.05)；與NI/R組比較，DCI組中1 h、6 h和24 h Bax陽性細胞增多，48 h下降但仍高于NI/R 組(P<0.05)；U0126組Bax陽性細胞較DCI組明顯減少(P<0.05)，見表2。

組別1h6h24h48hSO組33.60±2.5131.80±1.4834.80±2.9532.20±3.77NI/R組30.22±2.281)26.00±1.231)24.80±2.171)18.20±1.481)DCI組26.90±2.301)2)20.26±2.001)2)18.78±2.061)2)16.60±1.701)2)U0126組24.12±2.101)2)3)18.60±1.141)2)3)16.80±1.201)2)3)14.10±1.081)2)3)

與SO組同一時間點比較：1)P<0.05；與NI/R組同一時間比較：2)P<0.05；與DCI組同一時間點比較：3)P<0.05,下表同

SO組　　　　NI/R組　　　　DCI組　　　　U0126組 圖1　各組24 h海馬區磷酸化ERK1/2陽性 細胞變化免疫組織化學法(×200)

SO組　　　　NI/R組　　　　DCI組　　　　U0126組 圖2　各組24 h海馬區Bax陽性細胞 變化免疫組織化學法(× 200)

組別ERK1/21h6h24h48hBax1h6h24h48hSO組2.25±0.702.32±0.682.40±0.752.46±0.720.85±0.150.80±0.100.75±0.100.80±0.15NI/R組16.10±1.181)34.16±2.941)24.36±2.261)20.60±1.671)2.40±1.341)7.60±1.951)18.20±1.481)23.60±2.881)DCI組13.20±1.451)2)27.40±2.521)2)19.80±1.301)2)16.40±1.121)2)8.12±1.681)2)17.00±2.121)2)30.60±2.851)2)25.60±1.781)2)U0126組11.12±1.181)2)3)20.20±2.501)2)3)12.86±1.261)2)3)11.58±1.001)2)3)9.24±1.701)2)23.20±2.491)2)3)32.20±3.101)2)3)18.20±1.121)2)3)

3討論

MAPKs信號通路是連接大多數細胞外信號與膜受體、轉錄因子和各基因調節的中央信號通路，其家族成員包括細胞外信號調節激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK等。目前在多種中樞神經系統疾病中均證實存在 ERK1/2活性改變，但ERK1/2活化在腦損傷的作用尚存在一定爭議〔5，6〕。馬軼等〔7〕應用雙血管阻塞聯合放血法建立糖尿病大鼠全腦缺血模型，發現在糖尿病大鼠腦缺血1 h和3 h磷酸化ERK1/2顯著高于正常血糖腦缺血組，表明ERK1/2活性增高介導了糖尿病加重的腦缺血再灌注神經元的損傷。本研究結果提示糖尿病加重缺血神經細胞損傷與ERK1/2活性下降有關，進一步應用抑制劑U0126阻斷糖尿病大鼠腦缺血后ERK1/2通路活化，海馬區存活神經元數量降低明顯，視野內幾乎大多是壞死的神經細胞，更有力的說明糖尿病腦缺血再灌注后ERK1/2的活化對神經細胞具有保護作用。研究顯示〔8〕激活的ERK1/2可轉錄上調腦缺血缺氧模型中抗氧化系統的保護因子而促進神經元的存活；有學者認為活化的 Ras/ERK1/2級聯是神經元耐受腦缺血應激反應的核心〔9〕。筆者認為糖尿病合并腦缺血情況下，ERK1/2活性下降，使神經細胞耐受缺血缺氧能力下降，細胞死亡嚴重，是糖尿病鼠腦缺血后神經損傷加重的原因之一。

正常情況下，Bax蛋白含量極低，且Bax蛋白以非活性形式分布于細胞質或細胞骨架上，當受到凋亡刺激因素作用后構象發生改變，轉位至線粒體外膜，促進膜上電壓依賴離子通道開放、觸發凋亡蛋白釋放執行凋亡程序。實驗表明在糖尿病腦病以及糖尿病腦缺血再灌注損傷中Bax表達增多，且表達在瀕死的神經元上。抑制或降低糖尿病鼠腦內Bax表達，可顯著減輕由于高血糖加重的腦缺血神經細胞的損傷〔10，11〕。本研究中DCI組Bax表達增多，采用ERK1/2通路抑制劑預處理DCI再灌注動物，發現阻斷ERK1/2通路時Bax表達進一步升高，提示糖尿病加重腦缺血再灌注神經損傷過程中，ERK1/2活化可調控Bax表達，ERK1/2活性降低介導了Bax表達增加，而導致神經細胞丟失嚴重。目前雖然尚無有關ERK1/2磷酸化直接調控Bax表達的相關報道，但研究顯示ERK1/2磷酸化可介導激活轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白(CREB)以及CREB介導的bcl-2家族抗凋亡成員bcl-2表達增加〔9，12〕。

總之，本研究發現糖尿病加重了全腦缺血再灌注后神經細胞損傷，此過程中ERK1/2活性降低調控Bax表達增強，而導致神經細胞丟失嚴重。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)