三葉青水提物對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥的抑制作用

三葉青水提物對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥的抑制作用

王小莉 呂江明

(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000)

摘要〔〕目的探討三葉青水提物對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)實(shí)驗(yàn)性大鼠炎癥的影響。方法選擇煙熏加氣管內(nèi)注射脂多糖(LPS)法復(fù)制COPD模型，將健康SD雄性大鼠60只，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組，COPD模型組和三葉青低劑量、中劑量、高劑量組(分別為0.5、1.0、2.0 g/kg)，每組12只。造模成功后肺組織HE染色觀察氣道病理改變，測(cè)定血清和肺組織中C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素(IL)-6的水平，取支氣管肺泡灌洗液(BALF)測(cè)定炎癥細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞比率。結(jié)果三葉青各劑量組CRP、IL-6水平及炎癥細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞比例較模型組明顯減少(P<0.05)，高、中、低劑量組炎癥細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比例顯著下降，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組和各治療組中CRP、IL-6水平及炎癥細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)。結(jié)論三葉青水提物能夠抑制COPD大鼠的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞〔〕三葉青水提物；白細(xì)胞介素(IL)-6；C-反應(yīng)蛋白；慢性阻塞性肺疾病

中圖分類號(hào)〔〕R361〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2014SK3010)

三葉青屬于葡萄科屬植物，具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功效，臨床用來(lái)治療小兒驚厥高熱、肺炎、支氣管炎、咽喉炎、痢疾、肝炎、病毒性腦膜炎、腫瘤等癥〔1〕。三葉青對(duì)于炎癥的研究較少。本研究用三葉青水提物對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)觀察大鼠肺組織病理改變，檢測(cè)血清及肺組織中C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素6(IL-6)的水平，檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞及分類，探討三葉青對(duì)炎癥的影響及其機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD雄性大鼠購(gòu)買于湖南長(zhǎng)沙市開(kāi)福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部，動(dòng)物編號(hào)HNACSDC20120292，體重(272±28)g，鼠齡12 w。

1.2分組將60只大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組和三葉青低、中、高劑量組，每組12只。

1.3三葉青水提物的提取三葉青由呂江明老師在湖南吉首市郊采集，由我院中藥學(xué)李春艷教授鑒定。將三葉青全株500 g干燥、粉碎，過(guò)篩，水煎3次，每次30 min，合并水煎液，濃縮為1 g/ml(生藥)，得到三葉青水提物。

1.4COPD模型制作采用2次氣管內(nèi)注入LPS(LPS)和反復(fù)煙熏的方法制作COPD大鼠模型〔2〕。第1、14天各向氣管內(nèi)緩慢注入脂多糖200 μg (200 μl)，將大鼠放入的有機(jī)玻璃制成的煙熏箱內(nèi)，在其右上角開(kāi)通1個(gè)直徑1 cm的通氣孔，將點(diǎn)燃的香煙(長(zhǎng)沙卷煙廠白沙牌香煙)通過(guò)三通將煙霧吸入100 ml的注射器中，關(guān)閉吸煙通路一端，再打開(kāi)三通的另一端將煙霧注入煙熏箱內(nèi)進(jìn)行大鼠被動(dòng)吸煙，每天吸煙2次，每次16支，時(shí)間30 min，2次間隔4 h，連續(xù)28 d。吸煙8 d后每天吸煙前通過(guò)灌胃器給大鼠灌三葉青水提物(低劑量組、中劑量組、高劑量組為0.5、1.0、2.0 g/kg，加生理鹽水至2 ml)，共28 d。正常對(duì)照組灌入等容量的生理鹽水，28 d后處死大鼠用于實(shí)驗(yàn)觀察。

1.5肺組織病理學(xué)標(biāo)本制作各組于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日取每只大鼠右中葉肺組織，用4%甲醛固定24 h后石蠟包埋制成切片，HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6勻漿肺組織取500 mg肺組織，加入生理鹽水1.0 ml，組織勻漿器充分研磨，5 000 r/min離心10 min，取上清0.1 ml，加生理鹽水至1.0 ml，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.7血清采集從大鼠心臟取血約5 ml,3 500 r/min，離心半徑20 cm,10 min，取血清-20℃保存。

機(jī)械電氣一體技術(shù)在應(yīng)用的過(guò)程中，由于其具有數(shù)字顯示、程序控制功能，無(wú)需設(shè)計(jì)過(guò)多的手柄、按鈕，其操作相對(duì)比較方便。同時(shí)，鑒于該技術(shù)具有重復(fù)動(dòng)作的功能，可以自動(dòng)選擇程序，減少了操作人員的工作量。

1.8BALF的采集將大鼠右主支氣管結(jié)扎，用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無(wú)菌生理鹽水3 ml，重復(fù)3次，每次注入后立即回吸，灌洗液紗布過(guò)濾，回收率大于80%，得到BALF合格標(biāo)本。用于白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.9CRP、IL-6水平的測(cè)定利用H6000-020全自動(dòng)生化分析儀，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，大鼠CRP試劑盒、IL-6試劑盒購(gòu)買于湖北武漢博士德生物有限公司。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠病理改變正常對(duì)照組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮排列整齊，氣道、管壁及周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組的大鼠支氣管黏膜上皮變性、脫落，管壁伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡囊和肺泡擴(kuò)張明顯，肺泡壁變薄伴有不同程度的斷裂，形成肺大皰。三葉青低劑量、中劑量及高劑量組大鼠黏膜上皮改變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及肺泡腔擴(kuò)大、肺泡壁斷裂情況較模型組有不同程度的減輕，較正常對(duì)照組重。見(jiàn)圖1。

模型組

對(duì)照組

三葉青低劑量組

三葉青中劑量組

三葉青高劑量組

圖1各組大鼠病理改變(HE，×100)

2.2實(shí)驗(yàn)大鼠血清及肺組織勻漿中CRP、IL-6的測(cè)定與正常對(duì)照組比較，模型組血清及肺組織中的CRP、IL-6明顯增多(P<0.01)。與模型組比較，三葉青高、中、低劑量組血清及肺組織中的CRP、IL-6均減少(P<0.05)。三葉青低、中劑量組間血清及肺組織中的CRP、IL-6水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，三葉青高劑量組與低劑量組差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類與正常對(duì)照組比較，模型組中BALF炎癥細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。高、中、低各劑量治療組炎癥細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞比例較模型組減少，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別 CRP(μg/ml) IL-6(pg/ml) 血清肺組織血清肺組織白細(xì)胞總數(shù)(×108/L)中性粒細(xì)胞(%)單核細(xì)胞(%)淋巴細(xì)胞(%)正常對(duì)照組0.4327±0.0230.6378±0.02317.98±2.1240.23±0.131.78±0.813.48±0.5384.38±8.1312.91±6.89COPD模型組1.238±0.0171)1.6380±0.0251)60.23±3.181)101.22±0.231)5.88±0.491)21.98±4.991)70.03±6.127.86±3.28低劑量治療組0.9253±0.0122)0.9025±0.0322)40.82±2.092)70.94±0.152)4.28±0.452)15.28±3.152)77.27±5.137.23±2.28中劑量治療組0.8438±0.0342)0.8256±0.0202)34.28±3.322)55.83±0.222)3.23±0.231)2)14.38±2.781)2)79.29±4.896.53±1.98高劑量治療組0.5500±0.0182)3)0.4416±0.0062)3)30.89±2.142)3)50.78±0.142)3)2.13±0.382)3)10.23±2.082)3)80.23±4.326.98±3.21

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.05，與三葉青低劑量組比較：3)P<0.05

3討論

吸煙可刺激單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥因子、趨化因子及細(xì)胞因子，如TNF、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、IL-6、IL-8等，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附、移行到炎癥部位參與炎癥反應(yīng)〔3〕。LPS為革蘭陰性菌的外層結(jié)構(gòu)可直接造成氣道上皮損傷,又可激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,生成前致炎因子腫瘤壞死因子(TNF)、IL-1、IL-6等,趨化并激活中性粒細(xì)胞,釋放蛋白酶等細(xì)胞毒性物質(zhì),導(dǎo)致支氣管慢性炎癥及肺氣腫形成〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熏煙加氣管內(nèi)注射LPS法建立COPD大鼠模型，光學(xué)顯微鏡下觀察到COPD模型組大鼠肺泡壁、支氣管壁、肺泡間隔可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層、肌層、血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁變薄斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺大皰形成，符合COPD病理改變。采用兩次氣管內(nèi)注入適量LPS和反復(fù)熏煙的方法,可成功地復(fù)制出大鼠COPD 模型。本研究結(jié)果說(shuō)明三葉青可以減輕COPD肺組織炎癥病理改變，對(duì)COPD炎癥有一定的防治作用。

近年研究表明，COPD氣道炎癥是以淋巴細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，這些被激活的炎癥細(xì)胞可釋放許多炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子，參與氣道炎癥的進(jìn)展，而IL-6、IL-8是參與COPD氣道炎癥的重要細(xì)胞因子〔4,5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明COPD氣道及肺組織中的炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，與曹麗華等〔6〕研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果提示IL-6參與了COPD的炎癥反應(yīng)，是介導(dǎo)COPD炎癥重要的細(xì)胞因子，三葉青提取物可以降低IL-6的含量，對(duì)炎癥有一定的抑制作用。

CRP是一種對(duì)多種刺激因素包括感染、組織損傷、壞死都能迅速發(fā)生反應(yīng)的蛋白，常可作為一種反應(yīng)炎癥、組織損傷程度以及評(píng)價(jià)治療反應(yīng)的非特異性敏感指標(biāo)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明CRP在COPD具有較高的表達(dá)，CRP參與了COPD的炎癥反應(yīng)，是反映病情的重要生物學(xué)標(biāo)志。三葉青通過(guò)減低CRP的表達(dá)對(duì)大鼠COPD的炎癥有一定的抑制作用，并且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。

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〔2013-12-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)