重組人乳鐵蛋白對口腔癌Tca8113細(xì)胞周期及周期調(diào)控因子cyclinD1、p19和p27基因表達(dá)的影響

重組人乳鐵蛋白對口腔癌Tca8113細(xì)胞周期及周期調(diào)控因子cyclinD1、p19 和 p27 基因表達(dá)的影響

萬英明

(吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，吉林吉林132021)

摘要〔〕目的探討重組人乳鐵蛋白(rhLF)對口腔癌Tca8113細(xì)胞周期以及其調(diào)控因子cyclinD1、p19和p27基因表達(dá)的影響。方法使用0、50和100 μg/ml rhLF處理體外培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞24、48、72 h，采用流式細(xì)胞儀、MTT法和RT-PCR法分析細(xì)胞周期、活細(xì)胞情況及cyclinD1、p19和p27基因表達(dá)。結(jié)果100 μg/ml rhLF細(xì)胞處理組24、48、72 h OD值分別為(0.254±0.009)、(0.362±0.011)和(0.422±0.012)，明顯低于其他rhLF細(xì)胞處理組；100 μg/ml rhLF細(xì)胞處理組24、48、72 h G0/G1期細(xì)胞數(shù)分別為(63.20±3.48)%、(65.28±4.30)%和(67.38±3.11)%，明顯高于其他rhLF細(xì)胞處理組(P<0.05)；隨rhLF濃度和作用時間的增加，G0/G1細(xì)胞比例逐漸增大；100 μg/ml rhLF細(xì)胞處理組24 h cyclinD1 mRNA相對表達(dá)量為(0.21±0.07)，明顯低于其他rhLF細(xì)胞處理組(P<0.05)；各細(xì)胞處理組p19和p27 mRNA相對表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論rhLF可降低cyclinD1的表達(dá)，抑制Tca8113細(xì)胞增殖，有明顯的G0/G1期阻滯作用。

關(guān)鍵詞〔〕重組人乳鐵蛋白；口腔癌；細(xì)胞周期；調(diào)控因子

中圖分類號〔〕R739.8〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：吉林省衛(wèi)生廳科研課題基金資助項目(No.2012ZC0022)

第一作者：萬英明(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事口腔修復(fù)學(xué)、口腔生物力學(xué)研究。

口腔癌患者因其疾病分類不同而表現(xiàn)為不同的臨床癥狀，但通常伴有吞咽困難、語言困難、腫塊、結(jié)節(jié)、潰瘍、鱗狀斑塊等，如疾病發(fā)展至晚期并出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移時還可能危及患者生命健康〔1〕。乳鐵蛋白(LF)是乳汁中的一種重要糖蛋白，具有廣譜的抗菌、抗氧化、抗癌及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，是新型抗癌藥物之一。本研究旨在分析重組人LF(rhLF)對口腔癌患者Tca8113細(xì)胞周期以及其調(diào)控因子cyclinD1、p19和p27基因表達(dá)的影響及作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料人口腔舌鱗癌Tca8113細(xì)胞系，重組人乳鐵蛋白，RMPI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，cyclin D1、p19、p27單抗，RT-PCR試劑盒，F(xiàn)ACSCLIBUR型流式細(xì)胞儀。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)選用上海細(xì)胞研究所提供的人口腔舌鱗癌Tca8113細(xì)胞系，選用DMEM小牛血清培養(yǎng)，于37℃，5%CO2環(huán)境下孵化、傳代。實驗選用接種24 h后的對數(shù)生長細(xì)胞。

1.3細(xì)胞周期檢測取2 ml對數(shù)細(xì)胞樣本1×106/ml接種于6孔板內(nèi)，將不同濃度的rhLF滴入孔板內(nèi)，結(jié)束培養(yǎng)。離心，棄上清，洗滌，乙醇固定過夜。離心并收集細(xì)胞，將細(xì)胞置于RNase A溶液中孵化，選用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，并選用細(xì)胞周期和軟件ModFit分析。

1.4cyclinD1、p19和p27基因表達(dá)檢測不同濃度的rhLF作用對數(shù)細(xì)胞樣本24 h后，搜集細(xì)胞并提取總RNA，PCR反應(yīng)，條件如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，32個循環(huán)，72℃延伸6 min。選用瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，并選用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖活性情況100 μg/ml rhLF細(xì)胞處理組24、48、72 h OD值明顯低于其他rhLF細(xì)胞處理組(P<0.05)，見表1。

rhLF24h48h72h0μg/ml0.355±0.0020.638±0.0100.857±0.12150μg/ml0.323±0.0050.451±0.0070.605±0.014100μg/ml0.254±0.0090.362±0.0110.422±0.012

F濃度=134.531，F(xiàn)時間=572.09，F(xiàn)濃度×?xí)r間=68.157，P均<0.05

2.2細(xì)胞周期測定情況100 μg/ml rhLF細(xì)胞處理組24 h、48 h、72 h G0/G1期細(xì)胞數(shù)明顯高于其他rhLF細(xì)胞處理組(P<0.05)；隨rhLF濃度和作用時間的增加，G0/G1細(xì)胞比例逐漸增大。見表2。

rhLF24h48h72h0μg/ml51.28±3.5652.46±4.2853.08±3.9150μg/ml59.57±2.6161.08±3.1364.13±4.08100μg/ml63.20±3.4865.28±4.3067.38±3.11

F濃度=42.181，F(xiàn)時間=22.542，F(xiàn)濃度×?xí)r間=11.264，P均<0.05

2.3cyclinD1、p19和p27基因表達(dá)情況100 μg/ml rhLF細(xì)胞處理組24 h cyclinD1 mRNA相對表達(dá)量明顯低于其他rhLF細(xì)胞處理組(P<0.05)；各細(xì)胞處理組p19和p27 mRNA相對表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

rhLFcyclinD1mRNAp19mRNAp27mRNA0μg/ml1.24±0.080.90±0.100.62±0.0950μg/ml0.67±0.040.89±0.110.63±0.10100μg/ml0.21±0.070.88±0.090.62±0.11F/P值45.271/<0.050.242/>0.050.231/>0.05

3討論

LF是一種廣泛分布于哺乳動物組織及分泌液中的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，其中粒細(xì)胞具有極強(qiáng)殺菌能力，并可調(diào)節(jié)人體鐵平衡，加速骨髓細(xì)胞的增殖，促細(xì)胞生長。此外，LF還具有抗病毒感染，調(diào)節(jié)免疫，增強(qiáng)人體素質(zhì)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種功效，其人工合成物rhLF已被廣泛用于消化道疾病、癌癥等疾病的防治工作中〔2〕。

臨床研究顯示，腫瘤發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控異常有關(guān)。健康細(xì)胞的分裂、增殖、凋亡均由各自基因調(diào)控，其中G1到S期，G2到M期是細(xì)胞周期的兩個關(guān)鍵時期，也是腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要靶時期〔3〕。本研究表明rhLF可通過作用Tca8113細(xì)胞G0/G1期生長組織，降低S期細(xì)胞，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并且這種抑制作用與劑量及作用時間呈正相關(guān)。有學(xué)者選用流式細(xì)胞儀檢測rhLF作用后Tca8113細(xì)胞DNA含量發(fā)現(xiàn)，不同濃度、不同作用時間的rhLF組均出現(xiàn)凋亡峰值，這表明rhLF無法直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但可以通過阻滯腫瘤細(xì)胞周期的來抑制其增殖〔4〕。

cyclinD1是細(xì)胞G1期周期素，是細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵因子，僅在G1期表達(dá)為陽性，在G2/M期則變化為陰性。cyclinD1還是腫瘤細(xì)胞發(fā)生、增殖的重要參與因子〔5〕。cyclinD1低表現(xiàn)提示rhLF可有效抑制口腔癌腫瘤細(xì)胞生長，并伴濃度特征。p19是胚胎癌細(xì)胞的一種，屬于INK4家族，與多種癌癥疾病發(fā)生及細(xì)胞衰老有關(guān)〔6〕。p19表達(dá)水平與蛋白水平相關(guān)，具有細(xì)胞周期依賴性，在G1期表達(dá)水平最低，而在S期表達(dá)水平最高。p19對cyclinD1-CDK4活性具有較強(qiáng)抑制作用，但對cyclinE-CDK2則無影響，可介導(dǎo)細(xì)胞停滯于G1、G2期〔7〕。p27蛋白是CKI家族成員之一，是臨床公認(rèn)的一種細(xì)胞周期調(diào)控負(fù)性調(diào)控因子，參與著多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展〔8〕。p27蛋白最早被作為cyclinE-CDK2抑制劑而被發(fā)現(xiàn)的，其可表達(dá)于靜止細(xì)胞內(nèi)，但如細(xì)胞被生長因子刺激，其表達(dá)水平將降低。當(dāng)細(xì)胞處于G1期時，p27蛋白可被cyclinD-CDK復(fù)合物螯合，當(dāng)cyclin-CDK水平高于p27蛋白抑制閾值后，細(xì)胞得以進(jìn)入G1期〔9〕。有學(xué)者在鹽酸?？颂婺崤c人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，鹽酸?？颂婺峥稍鰪?qiáng)p27蛋白表達(dá)，抑制cyclinD1表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G0/G1期，最終抑制腫瘤細(xì)胞增殖〔10〕。而本研究顯示rhLF對口腔癌細(xì)胞的阻滯能力與p19和p27蛋白無關(guān)。

綜上，rhLF可在體外降低cyclinD1的表達(dá)，使口腔癌Tca8113細(xì)胞停滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制口腔癌細(xì)胞增殖。但目前臨床尚無rhLF與細(xì)胞周期特異性藥物聯(lián)合治療口腔癌的報道，這可能與rhLF與細(xì)胞周期特異性藥物對腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制不明有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-12-19修回〕

(編輯苑云杰)