扎里奴思方對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠p-糖蛋白的影響

扎里奴思方對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠P-糖蛋白的影響

李娟吳鵬1劉敬霞劉洋

(寧夏醫科大學附屬國醫中醫醫院，寧夏銀川750004)

摘要〔〕目的比較缺血損傷不同時段大鼠血腦屏障P-糖蛋白(P-gp) 時征表達及回藥扎里奴思方對其表達的影響。方法SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組，線栓法制備腦缺血再灌注模型，分別灌胃給藥，于缺血再灌注后1、3、7、14 d取腦，檢測大鼠腦皮質及海馬區P-gp的表達。結果免疫組織化學染色結果顯示，假手術組與模型組大鼠腦皮質及海馬缺血區均可見P-gp陽性染色。與假手術組比較，不同再灌注時間模型組P-gp表達量均有顯著性差異( P<0.01) ，皮質及海馬缺血區P-gp 表達量均升高;與模型組比較，扎里奴思方組及尼莫地平組大鼠腦皮質及海馬區P-gp表達量明顯降低，尤以扎里奴思方3、14 d組為明顯(P<0.01) 。結論扎里奴思方發揮抗腦缺血損傷、神經元保護作用機制可能是通過調節血腦屏障上P-gp的雙向表達而實現的。

關鍵詞〔〕扎里奴思方；腦缺血再灌注損傷；血腦屏障；P-糖蛋白

中圖分類號〔〕R743〔文獻標識碼〕〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81260569)；寧夏科技支撐計劃(No.2012ZYH230)

通訊作者：劉敬霞(1970-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中醫、回醫藥防治老年病研究。

1固原市人民醫院

第一作者：李娟(1987-)，女，碩士，主要從事中醫、回醫藥防治腦缺血性疾病的研究。

Effects of Zhalinusi Fang on the P-glycoprotein changes after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

LI Juan, WU Peng,LIU Jing-Xia,etal.

Chinese Medicine Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia, China

Abstract【】ObjectiveTo research the P-glycoprotein(P-gp) expression on the blood-brain barrier at different times and the effect of Zhalinusi Fang after focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) in rats.MethodsSD rats were divided randomly into sham-operated，model，nimodipine and Zhalinusi Fang groups. Rat focal cerebral I/R model was established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread.After rats were administered orally with corresponding drugs 1,3,7,14 d,the brain was taken out.Immunohistochemical method was used to detect P-gp expression in cerebral cortex and hippocampus.ResultsImmunohistochemical staining showed that in sham-operated and model groups, P-gp positive staining was visible at ischemic cerebral cortex and hippocampus region . Compared with that of sham-operated group, P-gp expressions of different reperfusion time model groups were significant different(P<0.01),P-gp expression at ischemic cortex and hippocampus were increased. Compared with those of model group, of P-gp expression at cerebral cortex and hippocampus of ZLNSF and nimodipine groups were significantly decreased (P<0.01).ConclusionsZhalinusi Fang could promote the cerebral protection,its mechanism may be related to bidirectional regulation the expression of P-gp at blood-brain barrier.

【Key words】Zhalinusi Fang(ZLNSF);Cerebral ischemia-reperfusion injury;Blood-brain barrier; P-glycoprotein

缺血性腦血管病是臨床多發病,可導致患者肢體功能缺損、生活質量下降等嚴重后遺癥，危害著人類的健康。現治療多從調控血腦屏障通透性方面進行研究〔1〕。P-糖蛋白(P-gp)在腦毛細血管內皮細胞上有著高度的表達，是阻礙藥物傳遞入腦的主要物質〔2〕。扎里奴思方是出自《回回藥方》治療腦病的常用方劑，本研究擬采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型進一步、探討其發揮抗腦缺血損傷、神經元保護作用是否通過調控血腦屏障上P-gp的表達變化實現的，為深入研究回族醫藥其腦保護作用的實驗依據。

1材料與方法

1.1動物雄性SD大鼠，清潔級，3～4月齡，體重(300±50)g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：NXXY(寧)2001-0001。

1.2藥物扎里奴思方(出自《回回藥方》，方藥組成：安息香3 g、干祖伐(即懷牛膝)24 g、法里公(即茴香)、兀沙吉(即乳香)、法忒刺撒里榮(即當歸)、木里葉(即沒藥)、撒法郎(即紅花)、蘆薈、伯思八牙(即水龍骨)、膃肭臍(即海狗腎)、阿夫忒蒙(即菟絲子)、石菖蒲各12 g、肉桂6 g、丹皮9 g)制劑由吳忠市回醫中醫院制劑室提供,方中所用生藥材去除雜質，按組方劑量配比，煎煮濾取煎液后濃縮至藥液含生藥3.0 g/ml，4℃保存備用；用前稀釋至生藥材含量為1.5 g/ml。尼莫地平片(拜耳醫藥保健有限公司提供，30 mg/片，批號：H20003010)，用蒸餾水配成混懸液(1.08 mg/ml)。

1.3主要試劑和儀器蒸餾水(寧夏醫科大學實驗動物中心提供);水合氯醛(上海五聯化工廠,分析純,蒸餾水配成10%溶液W/V);尼龍線(直徑0.26 mm，長5 cm，用細砂紙打磨使頭端光滑、鈍圓、再用肝素溶液浸泡5 min,晾干,紫外線消毒備用)；電熱恒溫干燥箱(FX4-2，Shellab公司);電子天平(BT224S，Sartorius公司)；病理圖像分析軟件(技易科技)，P-gp(SC-673，稀釋至1∶64，試劑購自Santa cruz Biotechnology)。

1.4分組與給藥隨機抽取10只作為假手術組，余成模后隨機分至模型、尼莫地平、扎里奴思方1、3、7、14 d組內。所有動物于成模清醒后2 h按相應分組灌胃給藥,給藥劑量按動物與人體表面積折算：扎里奴思方1.5 g/ml；尼莫地平1.08 mg/ml，模型組和假手術組以生理鹽水代替，1次/d。

1.5動物模型的制備參照線栓法制備局灶性腦缺血動物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定，頸正中切口，鈍性分離頸內外動脈，穿線備用；于頸外動脈近動脈分叉處剪口，穿入栓線，進線長度(19±2)mm，穿線成功后記錄時間，縫合皮膚，在2 h后進行缺血再灌注，拔出栓線后縫合皮膚。假手術組只分離頸總、頸內外動脈，不穿入栓線。手術過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃,保持室溫(26±1)℃。

1.6腦組織P-gp水平測定通過P-gp含量來評價血腦屏障通透性的變化。用Image Pro Plus 6.0圖像全自動分析系統分析P-gp表達。測出iod sum和area sum值，取其平均值，平均光密度值=iod sum/area sum，反映P-gp含量的表達。

2結果

假手術組與模型組大鼠腦皮質及海馬缺血區均可見P-gp陽性染色。與假手術組比較，不同再灌注時間模型組P-gp 表達量均有顯著升高(P<0.01)，皮質及海馬缺血區P-gp表達量顯著升高與模型組比較，扎里奴思方組及尼莫地平組大鼠腦皮質及海馬區P-gp 表達量明顯降低，尤以扎里奴思方3、14 d組、尼莫地平7 d組最明顯(P<0.01) 。組內比較：與模型1 d組相比，3 d組P-gp表達明顯增加達高峰，7～14 d其含量逐漸回落；扎里奴思方與尼莫地平組3 d達高峰至7、14 d P-gp表達呈逐漸降低趨勢(P<0.05，P<0.01)。見表1。

組別1d3d7d14d假手術組83.43±13.8483.43±13.8483.43±13.8483.43±13.84模型組138.075±9.881)153.853±3.181)5)146.41±17.131)5)6)145.59±8.461)5)6)尼莫地平組137.83±4.051)146.78±18.701)2)5)129.39±11.911)2)5)6)119.22±8.251)2)5)6)扎里奴思方組127.89±17.231)142.69±9.121)2)3)5)140.34±15.841)2)4)5)117.13±9.101)2)5)6)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與尼莫地平組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與1 d組比較：5)P<0.01；與3 d組比較：6)P<0.01

3討論

血腦屏障(BBB)是腦與血液及腦脊液之間的一種屏障,與中樞神經系統的變性、損傷密切相關。其阻礙機制通常分為兩部分〔3，4〕：①結構導致的，對于大分子物質的物理屏障；②由其上面的多種信號物質導致的，對小分子物質起作用的化學電荷屏障。P-gp在維持BBB屏障功能、保持腦內環境的穩定、限制外源性毒物或藥物進入方面有重要作用,但同時也限制了治療性藥物在腦內的濃度,從而使治療效果減弱〔5～9〕。在缺血中風性疾病中，深入研究P-gp功能及作用機制有助于選擇性調控BBB功能,對提高腦內藥物的濃度和中樞神經系統藥物的生物利用度具有重要意義。本實驗結果顯示,腦缺血后模型組呈現了針對腦損傷的P-gp反應性表達增加又逐漸下降趨勢，藥物組的表達趨勢相同；但是，腦缺血治療引起的P-gp表達量改變及持續時間均顯示治療后P-gp的表達對缺血損傷的神經元起到了全面而持久的保護作用〔10，11〕。因此，采用可調控P-gp雙向表達的治療措施，對缺血后神經元損傷的保護具有重要意義。前期研究〔12～14〕發現，扎里奴思方具有抗腦缺血損傷、神經元保護作用。本研究進一步顯示：扎里奴思方在一定時限可以促進大鼠腦缺血再灌注損傷后P-gp的表達，加強有害物質的外排；然而在缺血再灌注損傷3 d后，其表達又趨于抑制，P-gp的表達量急速回落，且隨著時間的延長其抑制作用逐步增強，而這種變化趨勢與腦缺血后BBB通透性的變化幾乎一致〔15〕。

扎里奴思方具有芳香開竅、益髓補腎、活血祛瘀等作用，切中腦中風后痰蒙神竅、氣虛血瘀等諸病機，有很好的抗缺血損傷、神經元保護作用，后期可以減輕缺血腦組織中P-gp的滲出，減少治療性的藥物外排，增加藥物在腦內濃度，從而起到BBB保護性治療作用，還可以減少有害物質的進入和腦實質水腫的發生，改善受損神經功能恢復。本文結果也顯示扎里奴思方可有效改善術后大鼠腦組織病理損傷和促進大鼠神經功能恢復，且其作用隨著用藥時間延長而逐步增強，其變化趨勢與P-gp變化趨勢一致，本文可認為扎里奴思方對腦缺血再灌注后腦組織的保護作用可能是通過調節BBB中P-gp的表達實現的。

4參考文獻

1涂春華，楊冬梓.P-糖蛋白結構及作用機制〔J〕.生物化學與分子生物學報，2009；25(1)：7-1.

2Loscher W,Potschka H.Blood-brain barrier active efflux transporters:ATP- binding cassette gene family〔J〕.NeuroRx,2005;2(1):86-98.

3Weiss N,Miller F,Cazaubon S.The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases 〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009;1788(4):842-57.

4鄭躍英，蘭允平，祝勝美.大鼠腦缺血/再灌注損傷后梗死灶周圍水通道蛋白4與血腦屏障通透性的動態變化〔J〕.中國病理生理雜志，2008；24(8)：1647-9.

5金路，喻斌，董小平，等.血腦屏障上的P- 糖蛋白及其他ABC 超家族轉運蛋白的調控〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2012；23(4)：493-6.

6Ho EA,Piquette-Miller M.Inhibition of P- glycoprotein activity at the primate blood- brain barrier increases the distribution of nelfinavir into the brain but not into the cerebrospinal fluid〔J〕.Curr Cancer Drug Targets,2006;6(4):295-311.

7王玉璘，王少峽，郭虹，等.血腦屏障中P-糖蛋白的調節機制〔J〕.中國藥理學通報，2011；27(9)：1196-200.

8Liow JS,Kreisl W,Zoghbi SS,etal.P- glycoprotein function at the blood- brain barrier imaged in monkey with 11C- N- desmethyl-Loperamide〔J〕.J Nucl Med,2009;50(1):108-15.

9Mealey KL,Greene S,Bagley R,etal.P- glycoprotein contributes to the blood- brain，but not blood- cerebrospinal fluid，barrier in a spontaneous canine P- glycoprotein knock out model 〔J〕.Drug Metab Dispos,2008;36(6):1073-9.

10何治，陳濤，姚嵐.P-糖蛋白在血腦屏障中的作用〔J〕.山東醫藥，2011；51(25)：113-4.

11Zhang L,Li XD,Xiu L,etal.Pglyeoprotein restricted transport of nimodipine across blood-brain barrier 〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2003;24(9):903-6.

12單曉宇，劉敬霞，楚國慶，等.回藥扎里奴思方對腦梗死患者頸動脈硬化的影響〔J〕.寧夏醫科大學學報，2012；34(8)：753-6.

13劉敬霞，李建生，牛陽，等.扎里奴思方和蜜煎菖蒲方對腦缺血大鼠神經元損傷的影響〔J〕.寧夏醫科大學學報，2011；33(11)：1001-3.

14劉敬霞，李建生，牛陽，等.扎里奴思方和蜜煎菖蒲方對腦缺血大鼠血栓形成和血小板聚集的影響〔J〕.寧夏醫科大學學報，2011；33(12)：1117-9,1130.

15Jin XC,Liu J,Yang Y,etal.Spatiotemporal evolution of blood brain barrier damage and tissue infarction within the first 3 h after ischemia onset〔J〕.Neurobiol Dis,2012;48(3):309-16.

〔2013-11-15修回〕

(編輯曲莉)