線粒體乙醛脫氫酶2對(duì)β淀粉樣蛋白所致神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制

線粒體乙醛脫氫酶2對(duì)β淀粉樣蛋白所致神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制

楊英龔忠厚1李翠張倩王智斌韓亞軍陳陽葛偉

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，陜西西安710032)

摘要〔〕目的探討線粒體乙醛脫氫酶(ALDH)2對(duì)β淀粉樣蛋白(Aβ)所致神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制。方法應(yīng)用HT-22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，MTT法檢測(cè)明確Aβ25～35負(fù)載濃度制成Aβ神經(jīng)元損傷模型；ALDH2激活劑Alda-1、ALDH2抑制劑Daidzin 干預(yù)后，Western印跡檢測(cè)ALDH2蛋白表達(dá)水平；并采用ELISA檢測(cè)4-HNE含量、以熒光素酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP含量。結(jié)果HT22細(xì)胞負(fù)載Aβ25～35(濃度50 μmol/L)時(shí)細(xì)胞生存率有顯著降低；ALDH2激活劑Alda-1、ALDH2抑制劑Daidzin干預(yù)后，ALDH2蛋白表達(dá)水平并未發(fā)生變化，也并未導(dǎo)致細(xì)胞生存率改變；加入Alad-1后負(fù)載Aβ25～35的HT22細(xì)胞4-HNE含量顯著減少，細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯提高，與Aβ組相比較有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論ALDH2激活后能有效減輕Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，可能通過減少細(xì)胞內(nèi)4-HNE含量、增加ATP含量實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞保護(hù)的作用。

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默病；線粒體乙醛脫氫酶2；β淀粉樣蛋白

中圖分類號(hào)〔〕R592〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81271449，81471409)

通訊作者：葛偉(1972-)，女，副主任醫(yī)師，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年病學(xué)醫(yī)療、教學(xué)、科研工作。

1蘭州軍區(qū)臨潼療養(yǎng)院第二療養(yǎng)區(qū)

第一作者：楊英(1984-)，男，在讀碩士，醫(yī)師，主要從事阿爾茨海默病機(jī)制及治療研究。

Effects and mechanism of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 on neuronal damage caused by amyloid

YANG Ying, GONG Zhong-Hou, LI Cui,etal.

Department of Geriatrics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, Shaanxi, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) on neuronal damage induced by β-amyloid(Aβ).MethodsHT-22 mouse hippocampal neuronal cell line was used, MTT was used to determine Aβ concentration. Western bolt was used to detect ALDH2 protein level, ELISA was used to detect 4-HNE content, luciferase enzyme was used to detect intracellular ATP content.ResultsThe cell survival rate was significantly decreased when HT22 cells loaded with 50 μmol/L Aβ25～35. The expression level of ALDH2 protein and the cell survival rate of HT22 did not change when intervened by ALDH2 activator Alda-1 and the inhibitor Daidzin, further experimental results showed that Alad-1 could improve the increased 4-HNE content and the reduced ATP in HT22 when cells loaded Aβ25～35.ConclusionsALDH2 activation might elicit neuronal protective effect against Aβ25～35 through reducing 4-HNE levels and increasing ATP content of the intracellular.

【Key words】Alzheimer′s disease; Mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2;β-amyloid

乙醛脫氫酶(ALDH2)因其能夠直接、間接介導(dǎo)機(jī)體各組織器官、細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性反應(yīng)性醛類等物質(zhì)，在細(xì)胞保護(hù)方面起著舉足輕重的關(guān)鍵性作用〔1〕。ALDH2基因缺失增加患阿爾茨海默病(AD)的危險(xiǎn)性，ALDH2敲除小鼠更易遭受氧化應(yīng)激損傷、出現(xiàn)增齡相關(guān)性神經(jīng)退行性病理改變和記憶力喪失〔2〕。然而ALDH2能否在細(xì)胞水平、在β淀粉樣蛋白(Aβ)負(fù)載后所致AD細(xì)胞模型上實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)觀察ALDH2對(duì)Aβ所致海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系損傷的影響。

1材料和方法

1.1材料Aβ25～35購(gòu)于Sigma(SCP0014)公司。ALDH2抑制劑Daidzin購(gòu)自Enzo(CAS552-66-9)，ALDH2激活劑Alda-1購(gòu)自Gemany Merck(CSA349438-38-6)。HT22細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科惠贈(zèng)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞，以10%胎牛血清( Gibco 16000-044)和90%高糖DMEM( Gibco 11995-065)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件37℃孵箱5%CO2與95%空氣。密度60%～80%時(shí)加入藥物進(jìn)行干預(yù)。Aβ25～35溶解于無菌水中，37℃老化7 d。設(shè)計(jì)濃度梯度0、20、50、100 μmol/L 。ALDH2抑制劑Daidzin溶解于DMSO，ALDH2激活劑Alda-1溶解于DMSO，與Aβ共同加入細(xì)胞培養(yǎng)體系中。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3～5 d每孔加MTT溶液20 μl。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106傳代至六孔板中，第一組：空白對(duì)照組；第二組：Aβ50 μmol/L；第三組：Alda-1 50 μmol/L；第四組：Daidzin 60 μmol/L；第五組：Aβ 50 μmol/L+Alda-1 50 μmol/L；第六組 Aβ 50 μmol/L+Daidzin 60 μmol/L處理24 h后，送第四軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室流式細(xì)胞中心，進(jìn)行流式凋亡率檢測(cè)。

1.5ELISA檢測(cè)4-HNE含量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×105傳代至24孔板，分為六組分組同上所述，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔處理24 h，用PBS(pH7.2～7.4)稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成分，制成樣品進(jìn)行ELISA檢測(cè)。用純化的小鼠4-HNE抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入4-HNE再與HRP標(biāo)記的4-HNE抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的4-HNE呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠4-HNE濃度。

1.6Western印跡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，傳代至六孔板密度1×106，Alda-1組濃度設(shè)定分別0、10、20、50、100 μmol/L；Daidzin濃度設(shè)定分別為0、10、30、60、120 μmol/L藥物處理24 h后提取蛋白，配10%SDS-PCAG凝膠。一抗anti ALDH1/2 1∶1 000(Santa)過夜，二抗：山羊Anti-兔IgG H&L (HRP) (ab6721)。使用ImageJ軟件掃描灰度與GAPDH對(duì)比得出蛋白相對(duì)灰度值。

1.7熒光素酶法檢測(cè)ATP含量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106傳代至六孔板中，第一組：陰性對(duì)照組；第二組：Aβ 50 μmol/L；第三組：Alda-1 50 μmol/L；第四組：Daidzin 60 μmol/L；第五組：Aβ 50 μmol/L+Alda-1 50 μmol/L；第六組Aβ 50 μmol/L+Daidzin 60 μmol/L，處理24 h后，使用ATP檢測(cè)試劑盒(Beyotime S0026)按照步驟操作。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Aβ25～35對(duì)HT22的細(xì)胞損傷作用與空白對(duì)照組相比(3.51±0.25)，負(fù)載Aβ25～35濃度為20 μmol/L處理后細(xì)胞生存率無顯著變化(3.03±0.33,P>0.05)，Aβ25～35濃度50 μmol/L處理后，細(xì)胞生存率有顯著性降低(2.11±0.71,P<0.05)，且隨著Aβ25～35濃度增加至100 μmol/L細(xì)胞生存率(1.44±0.20)與50 μmol/L組無顯著性差別(P>0.05)。

2.2ALDH2對(duì)Aβ所致HT22細(xì)胞生存率的影響與陰性對(duì)照組(3.57±0.41)相比，Aβ組OD值明顯減低(2.17±0.93,P<0.05)；但單純應(yīng)用Alda-1(3.44±0.33)、Daidzin(3.37±0.28)后，與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞生存率無顯著性變化。與Aβ組相比，Aβ+Alda-1組細(xì)胞生存率明顯提高(3.31±0.47,P=0.02)；加入ALDH2抑制劑Aβ+Daidzin組較單純使用Aβ組細(xì)胞生存率無差異(1.36±0.35，P>0.05)。

2.3Alda-1、Daidzin對(duì)ALDH2蛋白表達(dá)含量及對(duì)HT22細(xì)胞生存率的影響不同濃度Alda-1或Daidzin處理HT22細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)ALDH2蛋白的含量無明顯變化；且對(duì)HT22細(xì)胞生存率亦沒有明顯影響(P>0.05)，見表1，圖1。

組別(μmol/L)吸光度(OD)組別(μmol/L)吸光度(OD)陰性對(duì)照組3.99±0.40陰性對(duì)照組3.27±0.16Alda-1103.53±0.91Daidzin103.44±0.53Alda-1203.51±0.11Daidzin303.31±0.33Alda-1503.62±0.08Daidzin603.68±0.08Alda-11003.41±0.77Daidzin1202.52±0.42

圖1　Alda-1、Daidzin對(duì)ALDH2蛋白表達(dá)含量的影響

2.4ALDH2激活劑及抑制劑對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制與陰性對(duì)照組相比，Aβ組4-HNE含量明顯增加(P<0.05)；但單純應(yīng)用Alda-1、Daidzin后，對(duì)4-HNE含量無顯著影響；與Aβ處理組相比，加入ALDH2激活劑Alad-1后4-HNE含量明顯降低(P<0.05)；使用ALDH2抑制劑Daidzin后4-HNE含量與Aβ組相比無明顯變化(P>0.05)。另外，熒光素酶法ATP含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，Aβ組ATP含量顯著降低(P<0.05)，ALDH2激活后能顯著改善細(xì)胞內(nèi)ATP含量，與Aβ組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

組別(μmol/L)4-HNE含量(ng/L)ATP含量(μmol/L)陰性對(duì)照組1.7±0.210.25±0.030Aβ504.1±0.631)0.11±0.0231)Alda-1501.6±0.110.22±0.025Daidzin601.8±0.160.23±0.024Aβ50+Alda-1502.4±0.212)0.21±0.0312)Aβ50+Daidzin604.4±0.351)0.10±0.081)

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05；與Aβ50組比較：2)P<0.05

3討論

本文結(jié)果提示ALDH2激活劑Alda-1能有效保護(hù)HT22細(xì)胞免受Aβ25～35損傷，并可能通過減少細(xì)胞內(nèi)4-HNE含量、增加ATP含量實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞保護(hù)的作用。

以乙酰膽堿酯酶抑制劑和(或)NMDA受體拮抗劑為主的藥物治療及對(duì)癥治療作為目前臨床治療AD的最主要方法，其療效十分有限〔3〕。ALDH2是一個(gè)核編碼線粒體酶，定位于線粒體基質(zhì)〔1〕，在細(xì)胞保護(hù)方面發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，能顯著減少酒精相關(guān)性疾病的發(fā)病率，減少缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞損傷〔4〕。ALDH2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中的作用目前仍不明確。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，ALDH2缺失型患者AD患病率明顯增高〔5〕；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALDH2基因敲除小鼠更易遭受氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)出增齡相關(guān)性神經(jīng)退行性病理改變及記憶力喪失等一系列神經(jīng)功能障礙；細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)顯示，在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中過表達(dá)ALDH2可有效抑制有毒醛類導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激及線粒體損傷〔6〕。ALDH2過表達(dá)有顯著的腦卒中后神經(jīng)元保護(hù)作用〔7〕。在小鼠的腦卒中缺血再灌注模型中過表達(dá)ALDH2能有效減輕氧自由基對(duì)神經(jīng)元造成的損傷，使缺血區(qū)再灌注區(qū)域的神經(jīng)元死亡數(shù)目減少〔8〕。但是，缺血再灌注和大量的有毒醛類處理和病理狀態(tài)下的AD神經(jīng)元損傷模式還是不同，以往實(shí)驗(yàn)均未涉及AD的核心機(jī)制——Aβ引起的神經(jīng)元損傷，也沒有回答ALDH2能否改善AD認(rèn)知功能障礙、實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)。

Aβ通過氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及促發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等途徑引起或促進(jìn)AD發(fā)展〔9〕。腦內(nèi)神經(jīng)元胞內(nèi)Aβ沉積是AD致病的核心機(jī)制之一，也是治療AD的潛在靶點(diǎn)之一〔10〕。4-HNE是細(xì)胞氧化應(yīng)激條件下脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生，能與線粒體DNA結(jié)合導(dǎo)致線粒體損傷及功能障礙的毒性醛類〔6〕。有報(bào)道ALDH2能發(fā)揮其還原酶的作用，脫氫形成對(duì)細(xì)胞無傷害的乙酸，恢復(fù)神經(jīng)元線粒體功能〔11〕。ATP是細(xì)胞最直接能量來源，是衡量線粒體功能的核心指標(biāo)，AD病理?xiàng)l件下神經(jīng)元線粒體ATP產(chǎn)生大量減少，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，是AD的重要發(fā)病機(jī)制。

本研究使用ALDH2的特異性激活劑Alda-1〔12〕，結(jié)果證實(shí)ALDH2激活能在細(xì)胞水平減少AD核心致病機(jī)制Aβ所致的神經(jīng)元損傷，從而減少神經(jīng)元的凋亡，并且這一作用可能與ALDH2含量關(guān)系不大，而與ALDH2還原酶活性有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示Alda-1可以減少4-HNE的產(chǎn)生，使線粒體功能得到修復(fù)，并使ATP產(chǎn)生明顯增加，進(jìn)一步提示ALDH2激活后產(chǎn)生的細(xì)胞保護(hù)作用可能與線粒體凋亡信號(hào)通路有關(guān)。

流行病學(xué)調(diào)查顯示ALDH2基因突變者更容易罹患AD〔13〕。我國(guó)人群的流行病學(xué)調(diào)查中，有40%中國(guó)人群中編碼ALDH2蛋白的基因存在缺陷，酶蛋白487位的谷氨酸(Glu)被賴氨酸(Lys)取代，得到?jīng)]有活性的ALDH2蛋白〔14〕。本文提示，ALDH2活性可能與AD發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而我國(guó)老年人群中大量的AD患者是否與ALDH2蛋白失活相關(guān)還需深入研究。

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〔2013-12-17修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)