加味五苓散對糖尿病神經源性膀胱模型大鼠的預防性作用

加味五苓散對糖尿病神經源性膀胱模型大鼠的預防性作用

劉煜洲李日東李賽美1操紅纓2劉超男李陽

(廣州中醫藥大學，廣東廣州510405)

摘要〔〕目的探討加味五苓散對糖尿病神經源性膀胱模型大鼠的預防性作用。方法將SD大鼠隨機分為空白組、模型組和加味五苓散高、中、低劑量組，采用高脂高糖飲食配合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導2型糖尿病大鼠模型，從行為學、組織形態學、尿動力學等方面對于加味五苓散預防性干預效果進行評價。結果經過糖尿病造模各組與空白組相比，出現明顯糖尿病征象，在血糖、體重、飲水量、食量、尿量等指標上均有顯著差異(P<0.05)；光鏡下模型組大鼠膀胱組織可見肌纖維排列紊亂，肌細胞形態各異，肌束間隙增寬等糖尿病神經源性膀胱典型病理狀態，中藥干預各組肌纖維排列、肌束間隙等病理狀態均有所改善；尿動力學方面，中劑量組大鼠在排尿時間和順應性等指標上優于模型組(P<0.05)。結論加味五苓散預防性給藥對糖尿病神經源性膀胱大鼠的膀胱組織有一定保護和修復作用，其預防機制可能與改善模型大鼠的逼尿肌功能有關。

關鍵詞〔〕加味五苓散；糖尿病神經源性膀胱；膀胱組織形態學；尿動力學

中圖分類號〔〕R256.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學

通訊作者：李賽美(1960-)，女，教授，博士生導師，主要從事經方治療疑難癥研究。

1廣州中醫藥大學第一附屬醫院2廣州中醫藥大學中藥學院

第一作者：劉煜洲(1987-)，男，博士，主要從事經方治療疑難癥研究。

Preventive efficacy of Jiawei Wuling powder on rats in diabetic bladder dysfunction

LIU Yu-Zhou，LI Ri-Dong, LI Sai-Mei,etal.

Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo assess preventive effect of Jiawei Wuling powder on rats with diabetic bladder dysfunction.MethodsFive groups were set up. Diabetes model rats were induced by high-fat diet and Streptozotocin (STZ) intraperitoneal injection. The evaluation included ways of animal ethology, histomorphology and urine dynamics.ResultsThe diabetic model groups had typical “a little more than three disease” syndrome. Meanwhile, the model control group rats had muscles derangement, abnormal muscle cell form and widen muscle bundle under optical microscope. However the herbal medicine groups showed ameliorating pathological state. The rats in moderate dose group were superior to those of model control group in voiding time and compliance(P<0.05).ConclusionsPreventive administration Jiawei Wuling powder could ameliorate rats' detrusor function and protect bladder tissue.

【Key words】Jiawei Wuling powder；Diabetic bladder dysfunction；Bladder histomorphology；Urine dynamics

糖尿病神經源性膀胱，主要表現為膀胱儲尿和排泄的雙重障礙，包括膀胱感覺功能障礙、尿潴留、排尿困難和逼尿肌功能紊亂等〔1,2〕，發病機制復雜，目前研究認為其與膀胱逼尿肌、尿道、自主神經和尿路上皮等結構的功能紊亂有關〔3〕。當代中醫學者多從理論闡述、經驗總結等角度研究該病，少見RCT臨床試驗和作用機制研究〔4〕。廣州中醫藥大學李賽美教授根據該病出現排尿異常之體征及“久病脾腎陽虛”之病機，在《傷寒論》專治“小便不利”的千古名方——五苓散〔5〕基礎上，組方加味五苓散，意在扶正固本，溫陽化氣，通調水道。前期研究顯示該方不僅能有效地改善患者的排尿癥狀，同時對尿路逆行感染有一定的防治作用〔6～8〕。本文運用加味五苓散對糖尿病神經源性膀胱模型大鼠進行預防性給藥干預。

1材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重180～220 g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0034；實驗大鼠均在廣州中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房進行飼養，屏障環境符合SPF級要求，許可證號：SYXK(粵)2013-0001。

1.2試劑與儀器鏈脲佐菌素(STZ，美國sigma公司)；檸檬酸；檸檬酸鈉；雅培安妥血糖儀及血糖試紙，尿動力學分析儀(Laborie公司)，組織脫水機(Leica TP1020)、石蠟包埋機(Leica EG1160)、病理組織切片機(Leica 2135)、多功能自動染色機(Leica ST5010)、顯微鏡(Leica DMR)。

1.3實驗方法

1.3.1加味五苓散制備加味五苓散組成為茯苓18 g、豬苓18 g、澤瀉30 g、桂枝12 g、白術18 g、烏藥10 g、炮附子10 g(先煎)、黃芪30 g，均由廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥房購自廣東省藥材公司中藥飲片廠，后將藥材置不銹鋼夾層鍋內，加純化水超過藥材面10 cm，浸泡30 min，熟附子先煎30 min，余藥材放入，通蒸汽煮沸1 h；取出首次煎煮藥液；再將藥渣進行第2次煎煮，時間1 h，合并2次煎煮提取藥液，濾過濃縮制成生藥含量1 g/ml的藥液，4℃冰箱保存備用，以上工序均委托廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥房完成。

1.3.2動物模型制備實驗大鼠經適應性喂養1 w后，除空白組正常飼養外，糖尿病模型各組大鼠給予高糖高脂飼料喂養4 w后，均按體重一次性腹腔注射45 mg/kg的1% STZ溶液(溶解STZ的緩沖液由檸檬酸和檸檬酸鈉按照1∶1.32的比例配置，pH4.2)，3 d后剪尾取血，血糖儀測量血糖>16.7 mmol/L說明糖尿病模型大鼠成功造模。

1.3.3分組和給藥將70只SD大鼠隨機分為空白組10只，模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組各15只。加味五苓散高、中、低劑量組經換算分別每日灌胃加味五苓散水煎液6 ml、3 ml、1.5 ml，連續灌胃8 w。

1.3.4觀察指標

1.3.4.1一般行為學觀察觀察動物毛色、活動度、飲水、進食、體重、精神狀態等，

1.3.4.2血糖及代謝狀況監測定期監測大鼠血糖，24 h代謝籠檢測大鼠食量、尿量、飲水量等代謝指標。

1.3.4.3尿動力學測定各組大鼠腹腔注射25%烏拉坦0.4 mg/kg，取下腹部切口實施膀胱頂造瘺，插入導管后封瘺口，導管經三通管連接尿動力儀和微量灌注泵，排空大鼠膀胱尿液后，微量灌注泵以30 ml/h的速率向膀胱灌注20℃～22℃生理鹽水，當大鼠出現排尿反應時，停止灌注生理鹽水。記錄排尿時間、逼尿肌壓等，計算出膀胱順應性。

1.3.4.4膀胱組織形態學觀察各組大鼠處死后取出膀胱組織，4%多聚甲醛固定，無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成約3 μm的組織片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察。

2結果

2.1一般行為學觀察空白組大鼠飲食正常，體重穩步增長，毛色均勻致密，有光澤。其余各組大鼠經糖尿病造模后均出現明顯多飲、多食、多尿的典型糖尿病癥狀，伴有精神不振、活動度低、毛色稀疏晦暗等。空白組大鼠無死亡，其余各組死亡數分別為7只、8只、7只和3只，可能與藥物注射導致胰島細胞過度破壞、大鼠難以耐受長期高血糖狀態等因素有關。

第0周時，各組大鼠體重無顯著性差異(P>0.05)，組間具有可比性。第4周即注射完STZ的第1周時，僅有中劑量組大鼠與空白組大鼠有統計學差異(P<0.05)，而在第8周和第13周時，糖尿病造模的各組大鼠體重均較空白組大鼠低(P<0.05)。見表1。

組別n第0周第4周第8周第13周空白組10220.90±25.60314.10±24.93431.77±43.36485.37±48.93模型組8210.43±16.40295.71±19.70,333.35±43.521)303.62±43.561)高劑量組7216.71±18.05291.57±29.001)335.00±18.851)338.31±55.321)中劑量組8213.38±23.49274.00±29.22302.95±54.021)283.48±55.401)低劑量組12217.50±8.76294.58±26.01284.73±24.791)295.90±52.401)

與空白組比較：1)P<0.05；表2、表3同

2.2加味五苓散對血糖的影響造模第0周，也就是STZ注射第3天時，糖尿病造模各組大鼠血糖顯著上升，與空白組相比均具有統計學差異(P<0.05)。提示本次實驗成功復制糖尿病大鼠模型。各組大鼠血糖在造模不同時間點無顯著差異，提示糖尿病大鼠模型穩定(P>0.05)，見表2。

2.3代謝指標統計24 h代謝籠結果顯示至第9周時糖尿病造模各組大鼠的食量、尿量和飲水量均較空白組大(P<0.01)。其中中劑量組食量、尿量和飲水量較各組有改善趨勢，但與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

組別n造模第0周造模第1周造模第3周造模第5周造模第7周造模第9周空白組105.98±0.716.61±0.725.84±0.805.86±2.024.22±0.695.16±0.62模型組823.07±4.881)24.20±7.491)21.37±4.411)27.28±0.911)23.58±3.751)27.80±0.001)高劑量組724.80±3.151)24.92±7.591)23.54±4.191)27.80±0.001)22.61±2.741)27.80±0.001)中劑量組819.82±7.511)24.52±6.671)24.62±4.021)27.31±0.731)21.62±5.311)26.62±2.001)低劑量組1223.47±6.161)26.07±5.971)25.64±2.531)27.80±0.001)24.97±2.621)27.43±0.871)

根據雅培安妥血糖儀說明書，該血糖儀測量上限為27.8 mmol/L，高于該值則血糖儀顯示為“H”，因此部分組別血糖統計為(27.8±0.00)mmol/L

組別n 造模第5周 造模第9周 尿量食量飲水量尿量食量飲水量空白組1026.50±9.8828.21±6.0537.90±18.3528.60±6.9728.19±5.7536.60±14.48模型組898.71±23.441)27.80±6.58117.42±33.21)175.71±29.311)37.18±5.711)205.71±23.471)高劑量組788.40±27.941)21.24±987114.80±26.51)199.60±11.261)38.12±3.091)218.80±1.791)中劑量組873.57±31.701)21.30±5.1881.57±31.831)162.40±44.521)32.88±4.63195.66±35.011)低劑量組12110.90±31.51)30.97±5.54129.60±23.041)187.00±11.361)39.65±3.381)219.60±0.841)

2.4尿動力學與空白組相比，模型組呈現排尿時間延長、順應性增高等特點，兩者相比具有顯著性差異。中藥各組和模型組相比，中劑量組大鼠排尿時間和順應性優于模型組(P<0.05)；高劑量組和低劑量組和模型組相比，排尿時間和順應性有減少的趨勢，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5膀胱組織形態學結果光鏡下顯示：空白組大鼠膀胱逼尿肌纖維排列規整，肌細胞大小及形態正常。模型組可見膀胱壁增厚、肌纖維排列紊亂、肌細胞形態各異、肌束間隙增寬等病理狀態，出現糖尿病神經源膀胱典型病理改變。中藥干預各組可見部分肌纖維排列較亂，但較模型組相比，肌纖維排列、肌束間隙等病理狀態均有所改善。見圖1。

組別n排尿時間(s)最大逼尿肌壓(mmH2O)順應性(s/mmH2O)空白組102.17±1.3465.19±5.001.67±1.07模型組85.66±2.431)55.09±14.421)5.53±2.811)高劑量組75.39±3.111)55.42±7.591)4.84±2.901)中劑量組82.88±1.822)52.47±7.402.66±1.402)低劑量組124.87±2.871)56.77±10.341)4.24±3.261)

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

圖1　各組膀胱組織光鏡觀察結果

3討論

糖尿病神經源性膀胱是常見的糖尿病并發癥，但現代醫學對該病發生發展過程缺乏全面了解，除降糖、排尿訓練、間歇性清潔導尿等基礎治療外，尚未有特效的治療藥物。本研究在《傷寒論》名方“五苓散”基礎上，結合李賽美教授臨床經驗組成加味五苓散，強化原方溫陽益氣之效，前期臨床研究已證實對于糖尿病神經源性膀胱治療具有很好的療效。本研究結果表明，模型組大鼠逼尿肌功能受損，總之，本研究已經成功復制糖尿病神經源性膀胱大鼠模型，為進一步研究打下良好的基礎。加味五苓散對于糖尿病神經源性膀胱模型大鼠膀胱組織具有一定的保護和修復作用，尿動力結果提示加味五苓散可改善大鼠逼尿肌功能。

本研究表明加味五苓散預防性干預可在不影響血糖的基礎上，改善糖尿病神經源性膀胱模型大鼠膀胱逼尿肌功能，延緩逼尿肌相關病理改變，對于預防糖尿病神經源性膀胱的發生發展有一定作用。但本研究存在實驗大鼠死亡率偏高，未使用降糖藥物作為基礎干預手段等不足。未來擬在該方與降糖藥協同作用、分子作用機制、方藥量效等方面進行進一步研究，從而為加味五苓散防治糖尿病神經源性膀胱提供更多證據。

4參考文獻

1中華醫學會糖尿病分會.中國2型糖尿病防治指南(2010年版)〔J〕.中國糖尿病雜志,2012;20(1):1-36.

2Karoli R,Bhat S,Fatima J,etal.A study of bladder dysfunction in women with type 2 diabetes mellitus 〔J〕.Indian J Endocrinol Metab,2014;18(4):552-7.

3Wang Z,Cheng Z,Cristofaro V,etal.Inhibition of TNF-alpha improves the bladder dysfunction that is associated with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes,2012;61(8):2134-45.

4孫金玥，孫豐雷.中醫藥治療糖尿病神經源性膀胱研究進展〔J〕.河南中醫,2014;34(2):365-7.

5熊曼琪.中醫藥學高級叢書-傷寒論〔M〕.第2版.北京：人民衛生出版社,2011:166.

6李賽美.糖尿病辨病辨證治療五步法〔J〕.中醫雜志,2004;45(5):388-9.

7李賽美.淺談糖尿病及其并發癥六經辨治思路〔J〕.中華中醫藥雜志,2007;22(12):857-9.

8簡小兵.五苓散治療糖尿病神經原性膀胱療效觀察〔J〕.遼寧中醫雜志,2007;34(1):49-50.

〔2013-11-09修回〕

(編輯袁左鳴)