食管鱗狀細胞癌組織ULBP3的表達及與NK細胞的相關性

食管鱗狀細胞癌組織ULBP3的表達及與NK細胞的相關性

房新輝楊玉秀

(河南省人民醫院鄭州大學人民醫院消化內科，河南鄭州450003)

摘要〔〕目的探討食管鱗狀細胞癌組織UL16結合蛋白(ULBP)3的表達及與自然殺傷(NK)細胞的相關性。方法選取2012年1月至2013年12月在該院就診的食管鱗狀細胞癌患者48例，取食管鱗狀細胞癌組織、癌旁組織標本及外周血，采用免疫組化技術檢測標本中ULBP3的表達，采用流式細胞術測定NK細胞的含量，分析ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及與NK細胞的相關性。結果ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達高于癌旁組織(P<0.05)；食管鱗狀細胞癌組織中ULBP3的表達與外周血NK細胞含量呈正相關(r=0.596，P<0.05)；ULBP3的表達與食管鱗狀細胞癌的臨床分期及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)。結論食管鱗狀細胞癌組織ULBP3高表達，且可能和NK細胞的免疫調節過程相關。

關鍵詞〔〕食管鱗狀細胞癌；UL16結合蛋白3；自然殺傷細胞

中圖分類號〔〕R735〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：楊玉秀(1955-)，男，碩士，主任醫師，教授，博士生導師，主要從事消化道腫瘤方面的研究。

第一作者：房新輝(1981-)，男，碩士，住院醫師，主要從事消化道腫瘤方面的研究。

食管鱗狀細胞癌表現為角質細胞樣細胞之間存在細胞間橋或伴有角化〔1〕。自然殺傷(NK)細胞是機體遺傳性免疫系統的主要效應細胞，對病原體感染及惡性轉化的細胞具有自然細胞毒效應。NK細胞活化性受體(NKG2D)的配體在惡性腫瘤中有廣泛表達，可能和惡性腫瘤的惡性轉化、增殖、侵襲以及轉移相關〔2〕。UL16結合蛋白(ULBP)3是NKG2D的配體之一，主要表達于應激條件下的腸黏膜上皮細胞和上皮源性的腫瘤細胞〔3〕。本研究擬分析ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及其與NK細胞的相關性。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年1月至2013年12月在我院就診的經病理檢查確診為食管鱗狀細胞癌患者48例，在就診前均未行化、放療。年齡60～79〔平均(67.23±6.12)〕歲，男34例，女14例，腫瘤直徑1.1～10.0 cm；腫瘤位置食管上段17例，中下段31例；淋巴結轉移者21例；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期25例，Ⅲ期+Ⅳ期23例；組織學分級：Ⅰ級14例，Ⅱ級24例，Ⅲ級10例。取患者食管鱗狀細胞癌組織標本，同時取食管鱗狀細胞癌患者的癌旁正常組織作為對照，另每例患者取外周血5 ml。ULBP3兔抗人多克隆抗體及免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術公司，CD3-F1TC抗體、CD16/56-PE抗體、CD45-PC7抗體購于美國eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1鏈霉菌抗生物蛋白(SP)免疫組化法采用SP免疫組化法測定ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織及癌旁組織的表達，將食管鱗狀細胞癌組織標本和癌旁組織標本用石蠟包埋后備用，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。每份石蠟標本取3份切片進行連續性切片，脫蠟、水化。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。進行微波抗原修復，加入一抗后4℃過夜，再加入抗一抗的二抗后常溫孵育30 min，加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色液進行顯色再用HE復染。用已知的陽性組織切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。結果判定：在400倍光鏡下觀察記錄免疫組化結果，每份切片取10個高倍鏡視野進行雙人雙盲計數，記錄切片中陽性細胞占同類觀察細胞總數的百分比及著色深度。ULBP3定位在細胞質中，劃分為4個等級；陰性(-)：陽性細胞數少于觀察細胞總數的10%；陽性(+)：著色為淺黃色，且染色細胞數占觀察細胞總數10%～30%；中度陽性()：著色為黃色或深黃色，染色細胞數占觀察細胞總數30%～60%；強陽性()：細胞著色為褐色或棕褐色，染色細胞數占觀察細胞總數60%以上。

1.2.2流式細胞術采用流式細胞術測定外周血NK細胞的含量，每例患者取外周血4 ml行肝素鈉抗凝處理，通過葡聚糖泛影葡胺密度離心法分離出外周血單個核細胞，吸取100 μl外周血單個核細胞加入流式管中，再加入CD3-F1TC抗體、CD16/56-PE抗體、CD45-PC7抗體各5 μl，孵育15 min，用PBS洗滌1～2次，用多聚甲醛固定后上機檢測。采用Cell quest軟件分析外周血CD16+CD56+CD3+NK細胞占CD45+NK細胞的比例。

1.3統計學方法應用SPSS21.0軟件進行分析，計數資料采用χ2分析，等級資料表達陽性強度比較采用Wilcoxon秩和檢驗，相關性檢驗采用Spearman等級相關。

2結果

2.1ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中的表達免疫組化結果顯示，ULBP3在細胞質中表達，且ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達高于癌旁組織(“-”12 vs 33例，“+”10 vs 5例，“”12 vs 6例，“”14 vs 4例)(Z=11.378，P<0.05)。

2.2ULBP3表達和NK細胞含量在食管鱗狀細胞癌組織的相關性48例食管鱗狀細胞癌患者外周血標本NK細胞含量為(17.83±6.48)%，Spearman等級相關分析結果顯示，食管鱗狀細胞癌組織中ULBP3的表達和外周血NK細胞含量呈正相關(r=0.596，P<0.05)。

2.3ULBP3表達與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理指標的關系ULBP3的表達與食管鱗狀細胞癌的臨床分期及有無淋巴結轉移有關(P<0.05)。ULBP3表達在不同性別、腫瘤大小、腫瘤位置、組織學分級中差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1ULBP3表達與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理指標的關系〔n(%)〕

指標nULBP3總陽性χ2值P值性別 男3427(79.41)1.2100.271 女149(64.29)腫瘤大小(cm) <32622(84.62)2.7970.094 ≥32214(63.64)腫瘤位置 上段1712(70.59)0.2730.601 中下段3124(77.42)臨床分期 Ⅰ、Ⅱ期2515(60.00)6.2610.012 Ⅲ、Ⅳ期2321(91.30)組織學分級 Ⅰ級149(64.29)2.0570.358 Ⅱ級2418(75.00) Ⅲ級109(90.00)淋巴結轉移 有2119(90.48)4.7690.029 無2717(62.96)

3討論

食管癌是最常見的消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。我國是世界上食管癌的高發地區之一，病理組織學類型主要為食管鱗狀細胞癌〔4〕。NK細胞自然殺傷功能的發揮由NK細胞表面活化性受體和抑制性受體所傳遞的信號共同決定；NK細胞表面主要抑制性受體是殺傷細胞免疫球蛋白樣受體，其胞質區末端含有免疫受體酪氨酸抑制基序，其配體為組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子；NK細胞表面活化性受體主要分為MHCⅠ類分子特異受體和非MHC Ⅰ類分子特異的受體，包括C型凝集素樣家族成員NKG2D以及自然細胞毒受體；NKG2D是C型凝集素超家族所屬成員，其配體為MIC A/B和ULBP〔5〕。許多人類上皮源性腫瘤MIC蛋白均呈現高表達，并發現NKG2D在該類腫瘤周圍浸潤的淋巴細胞上也有表達，NKG2D和其配體交聯可激發NK細胞的細胞毒活性，起到腫瘤免疫監視中的重要作用〔6〕。NK細胞免疫應答的強弱由靶細胞表面NKG2D配體和人類白細胞抗原(HLA)分子的表達水平共同決定，ULBP3是NKG2D的配體之一，主要表達于應激條件下的腸黏膜上皮細胞和上皮源性的腫瘤細胞〔7〕。

本次研究結果說明ULBP3作為一種腫瘤標志物可能和食管鱗狀細胞癌的發生有關，此外，雖然在癌旁組織局部也有少量ULBP3表達，但和癌組織比較差異顯著，可能是由于炎性浸潤導致〔8〕。另外，研究提示在ULBP3可能對NK細胞數量有調控作用，這和之前的研究結果相似〔9〕。本研究還提示ULBP3可能參與了食管鱗狀細胞癌惡性轉化、增殖、侵襲以及轉移的過程，這和之前的研究結果一致〔10〕。

綜上，ULBP3在食管鱗狀細胞癌組織的高表達可能是食管鱗狀細胞癌發生發展的重要原因，并可能參與了NK細胞的免疫調節，為食管鱗狀細胞癌的診治和研究提供參考。

4參考文獻

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10陳德玉，汪茜茜，毛朝明.食管鱗狀細胞癌組織UL16結合蛋白3的表達和臨床意義及與自然殺傷細胞的相關性〔J〕.中華消化雜志，2012；32(10)：679-83.

〔2014-02-04修回〕

(編輯袁左鳴)