一對(duì)2型糖尿病老年雙生子基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)變化比較

一對(duì)2型糖尿病老年雙生子基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)變化比較

譚從娥馮文哲1王米渠2

(陜西中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷學(xué)教研室，陜西咸陽(yáng)712046)

摘要〔〕目的分析一對(duì)老年同卵雙生子2型糖尿病(T2DM)隨病程延長(zhǎng)而穩(wěn)定表達(dá)的基因功能特征。方法連續(xù)2年分6次調(diào)查一對(duì)老年雙生子的T2DM病情變化并作基因芯片實(shí)驗(yàn)，篩選出表達(dá)量隨病程延長(zhǎng)而連續(xù)升高的基因?yàn)殡p生子的共表達(dá)基因，通過FatiGO Compare工具比較兩組共表達(dá)基因功能注釋的異同。結(jié)果分別篩選到大、小雙的共表達(dá)基因473和529個(gè)，其中相同的共表達(dá)基因功能富集于“T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)” 基因本體(GO)類，不同的共表達(dá)基因功能差異體現(xiàn)在分子功能調(diào)節(jié)及刺激反應(yīng)2個(gè)GO類別。結(jié)論免疫功能基因的異常表達(dá)是該對(duì)雙生子T2DM隨病程延長(zhǎng)而穩(wěn)定出現(xiàn)的共性特征。

關(guān)鍵詞〔〕2型糖尿??；同卵雙生子；共表達(dá)基因；基因表達(dá)譜

中圖分類號(hào)〔〕R587.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81473559)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(No.2011JM4024)

1陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者：譚從娥(1972-)，女，副教授，博士，主要從事證侯的分子調(diào)控機(jī)制研究。

同卵雙生子間一致的表征可認(rèn)為與遺傳因素有關(guān)，不一致的表征則大多數(shù)與環(huán)境因素有關(guān)〔1〕。基因的表達(dá)會(huì)受到時(shí)空因素的影響，不同的外在環(huán)境會(huì)導(dǎo)致基因的表達(dá)量不同，本研究分析2型糖尿病(T2DM)同卵雙生子功能基因表達(dá)的異同，探討雙生子T2DM隨時(shí)間延長(zhǎng)而穩(wěn)定表達(dá)的功能基因特征。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象雙生子，女性，69歲，均出生并居住于四川省成都市。根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999頒布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，雙生子均為T2DM患者。大雙病史7年，小雙病史9年。理化檢查提示大、小雙目前無明顯的糖尿病并發(fā)癥。采用微衛(wèi)星DNA基因分型技術(shù)〔2，3〕鑒定雙生子卵型(同卵或異卵)，結(jié)果雙生子的15個(gè)基因座完全相同，說明這對(duì)雙生子為同卵雙生子。實(shí)驗(yàn)前均簽署知情同意書。

1.2理化檢查于2011年1月至2012年8月內(nèi)，每4個(gè)月一次完成雙生子T2DM患者全身體檢，每年3次，共6次。雙生子體檢于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心完成，項(xiàng)目包括一般情況、物理檢測(cè)、生化常規(guī)及糖化血紅蛋白等內(nèi)容。每次采取外周血以備完成基因芯片實(shí)驗(yàn)。

1.3基因芯片實(shí)驗(yàn)方法以大雙和小雙為實(shí)驗(yàn)組，以大雙的女兒為正常對(duì)照，每4個(gè)月一次共6次采取雙生子外周血，基因芯片實(shí)驗(yàn)于上海生物芯片有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程：取實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照每人外周血10 ml，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用上海生物芯片有限公司制備的cDNA人類全基因組表達(dá)譜芯片，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照分別用cy3和cy5標(biāo)記，進(jìn)行基因芯片雜交。芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀(Packard Bioscience公司)掃描，軟件讀取數(shù)據(jù)，采用Genespring進(jìn)行Normalize處理分析，最后ratio值為實(shí)驗(yàn)/對(duì)照。

1.4基因芯片數(shù)據(jù)分析共表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為6次檢測(cè)的差異基因中表達(dá)量連續(xù)升高的基因。采用FatiGO Compare數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)雙生子之間共表達(dá)基因的GO和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路注釋比較。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間比較行Fisher精確檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1雙生子實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果雙生子但T2DM病情的輕重程度差異較大，小雙重于大雙。大雙糖化血紅蛋白值介于6.0%～8.0%之間，血糖控制較為理想，小雙糖化血紅蛋白值在8.0%～9.0%之間，說明對(duì)血糖的控制較差。小雙的甘油三酯輕度升高，而且在2011年5月的體檢中發(fā)現(xiàn)血尿素氮(BUN)增高，大雙在3次體檢中這兩項(xiàng)指標(biāo)正常，提示大雙和小雙目前均無嚴(yán)重的肝腎功能損害。見表1。

2.2雙生子共表達(dá)基因篩選結(jié)果根據(jù)共表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)得到大雙共表達(dá)基因473個(gè)，小雙共表達(dá)基因529個(gè)，兩組共表達(dá)基因中相同的為15個(gè)，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道，M亞族β鏈成員4(KCNM)、Lysosomal相關(guān)的膜蛋白(LAMP)3、白介素(IL)-18、核孔蛋白210 kD(NUP210)、IL-12A、聚合酶(POLE4)、IL-1R1、環(huán)指蛋白(RNF)122、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)4、溶質(zhì)攜帶物家族38，成員(SLC38A)1、載脂蛋白L域含1(APOLD1)、早期反應(yīng)(IER)5、人白細(xì)胞抗原(HLA-DPA)1、賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(KDM)3A、人鳥苷酸核苷酸結(jié)合蛋白(GBP)4。

表1雙生子3年血生化及糖化血紅蛋白檢查結(jié)果(大雙/小雙)

2010-6-252011-6-72012-4-26空腹血糖7.35/13.68.09/13.7217.8/18.40餐后2h血糖9.90/16.7211.26/13.4210.54/18.74甘油三酯1.38/2.251.36/3.541.12/2.74血尿素氮(mmol/L)4.33/5.423.91/8.165.12/6.46糖化血紅蛋白(%)6.90/8.607.60/9.507.60/8.90

2.2.1雙生子相同的共表達(dá)基因功能注釋將相同的15個(gè)基因輸入FuncAssociate芯片數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái)，結(jié)果基因功能注釋只有1個(gè)顯著性GO類(P<0.05)，即T細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)，有3個(gè)基因(IL-18、IL-12A、IRF4)被注釋到該GO術(shù)語(yǔ)。KEGG通路注釋發(fā)現(xiàn)，15個(gè)基因被注釋到19條分子通路，其中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路具有顯著性，3個(gè)基因IL-18、IL-12A、IL-1R1在該通路中得到注釋。

2.2.2雙生子不同共表達(dá)基因的功能注釋比較將雙生子共表達(dá)基因輸入FatiGO Compare數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋比較，移去兩組基因中相同的基因，大雙473個(gè)共表達(dá)基因中有321個(gè)基因獲得注釋，小雙529個(gè)共表達(dá)基因中有206個(gè)基因獲得注釋。在GO生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞成分3個(gè)層次，分別有2、3和3個(gè)GO術(shù)語(yǔ)在雙生子間有顯著性差異(P<0.05)，見表2。在KEGG通路注釋比較差異沒有顯著性(P>0.05)。

表2雙生子不同共表達(dá)基因功能注釋比較〔n(%)〕

GO術(shù)語(yǔ)GO類別/水平小雙基因數(shù)目大雙基因數(shù)目P值分子功能調(diào)節(jié)(GO:0065009)生物學(xué)過程/35(29.2)0(71.8)0.01生物刺激反應(yīng)(GO:0009607)生物學(xué)過程/30(0)8(100)0.02RNA結(jié)合(GO:0003723)分子功能/42(18.4)13(81.6)0.03核糖核蛋白復(fù)合體(GO:0030529)細(xì)胞成分/60(0)7(100)0.04

3討論

T2DM是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所形成的復(fù)雜疾病。研究〔4，5〕表明，T2DM在同卵雙生子中具有高度的患病一致性，但是即便是同卵雙生子，T2DM的患病仍然具有差異性和非同步性的特點(diǎn)，具體表現(xiàn)為發(fā)病時(shí)間的不一致性、病情輕重程度的差異性以及并發(fā)癥出現(xiàn)的不同性等。本研究選擇的雙生子姐妹為同卵雙胞胎，雖然都確診患T2DM，但二者病程、輕重程度及兼癥等都有很大的不同。和大雙相比，小雙T2DM發(fā)病時(shí)間早、病情程度重，在連續(xù)2年的6個(gè)觀測(cè)點(diǎn)上，空腹血糖值均明顯高于大雙，血糖控制不理想。隨著病程的延長(zhǎng)，二者的病情程度均有加重，但是加劇的程度不一致，小雙出現(xiàn)腎功的輕度損傷。說明同卵雙生子雖然遺傳基礎(chǔ)相同，所患疾病名稱相同，但是疾病的具體表現(xiàn)形式仍存在很大的差異。 通過對(duì)雙生子連續(xù)2年6個(gè)時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的綜合分析，篩選出了大雙和小雙跟病情發(fā)展相關(guān)的共表達(dá)基因473和529個(gè)。這些共表達(dá)基因的表達(dá)量均隨著病程的延長(zhǎng)而逐漸增加，因此可認(rèn)為這些基因和T2DM的病情加劇密切相關(guān)。雙生子兩組共表達(dá)基因中有15條相同的基因，GO功能注釋“T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)”出現(xiàn)顯著性。T細(xì)胞在特異性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵性作用，不僅負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫，對(duì)體液免疫也起重要的輔助和調(diào)節(jié)作用〔6〕，而且在老年T2DM患者中，T細(xì)胞亞群數(shù)量和各亞群之間的比例和患者的血糖水平明顯相關(guān)〔7〕，提示免疫功能紊亂是這對(duì)雙生子T2DM隨病程延長(zhǎng)而穩(wěn)定出現(xiàn)的共性特征。雙生子之間不同的共表達(dá)基因在多個(gè)GO術(shù)語(yǔ)得到注釋，這些術(shù)語(yǔ)中有顯著性差異的GO主要為分子功能調(diào)節(jié)和生命刺激兩類，說明同卵雙生子T2DM患病分子基礎(chǔ)的差異性，差異的形成主要與雙生子間的個(gè)體因素及生活環(huán)境的不同有關(guān)，值得深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)這對(duì)老年雙生子T2DM患病分子基礎(chǔ)既存在共性又存在差異，共性特征是都存在免疫功能的異常，差異性主要體現(xiàn)在二者分子功能調(diào)節(jié)及刺激反應(yīng)等方面的調(diào)節(jié)不同。

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〔2013-09-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)