黃板樹根提取液對白細胞介素-18在骨性關節炎滑液中的表達影響及意義*

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黃板樹根提取液對白細胞介素-18在骨性關節炎滑液中的表達影響及意義*

王鳳龍1肖智青1朱錦忠1王愛明1徐洲發1張火林1江建明2

（1廣東省河源市中醫院河源517000；2南方醫科大學附屬南方醫院廣東廣州517515）

摘要：目的：了解使用黃板樹根提取液外用熏洗對骨性關節炎（osteoarthritis，OA）患者白細胞介素-18（Interleukin 18，IL-18）在滑液中表達的影響及意義。方法：觀察正常膝關節滑膜組織與OA病變滑膜組織在組織形態及病理切片的差異，對OA患者（n=30）使用黃板樹根提取液熏洗治療，分別提取治療前后的關節滑液，采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）定量檢測熏洗治療前后關節滑液中IL-18蛋白的表達水平，并比較其表達的差異。結果：正?；そM織肉眼觀為淡紅色或瓷白色，OA滑膜組織多為粉紅色；病理切片顯示：相比正?；そM織，OA滑膜組織出現明顯的血管增生和炎細胞浸潤，符合組織慢性炎癥病變特征；ELISA檢測治療前OA患者滑液中IL-18的表達含量為（52.625±11.336）pg/ml，治療后OA患者滑液中IL-18的表達含量為（22.512±2.021）pg/ml，兩者之間具備統計學差異（P＜0.05）。結論：黃板樹根提取液熏洗治療可以使OA關節滑液中炎性因子IL-18表達水平下降，提示黃板樹根提取液可能對OA有一定的治療作用。

關鍵詞：骨性關節炎；黃板樹根提取液；白細胞介素-18；滑液

廣東省河源市社會發展科技計劃項目（編號：2013054）

在中老年人發病排行上，骨性關節炎（osteoarthritis，OA）僅次于心腦血管疾病，排于第二位，它是一種十分常見的老年骨關節退行性病變[1]。它的發病機制主要是由于抗炎因子與促炎因子失衡，從而導致關節軟骨破壞和滑膜炎癥反應。隨著社會生活節奏的不斷加快以及人口老齡化的迅速發展,各種因素造成的骨關節損傷和退變已經成為骨科醫師面臨的最普遍、最嚴峻的問題。從病因學方面來講，骨性關節炎主要表現在兩大方面：一是各種原因造成的軟骨細胞性狀改變，最后導致關節軟骨發生破壞；二是滑膜組織發生炎癥反應致使滑膜細胞受到炎性刺激，繼而釋放大量的炎癥介質。通過既往研究發現，滑膜細胞可以釋放的炎性介質有多種，白細胞介素-18（IL-18）是近年來人們通過研究發現的一種新的致炎細胞因子[2]，它的生物學功能主要為介導組織炎癥反應，并且與一些自身免疫性疾病有關聯。多年來，醫學研究工作者都在不斷探索尋找一種積極而有效的治療OA的方法，西醫治療從早期的口服藥物治療和關節腔注射，到中期的關節鏡治療，以至于終末期的人工關節置換術。雖然在關節疾病發生發展的某一過程中上述治療都起到了一定的效果，但同時漫長的病程及高額的醫療費用也給患者及家屬帶來沉重的心理壓力和經濟負擔。所以，尋找一種廉價、方便、且有效的骨性關節炎治療方法，成為醫學界的共識[3]。

中醫學按辨證論治將骨性關節炎分為三種證型：風寒濕痹證、瘀血痹阻證和肝腎不足證。中醫認為，本病的發生以腎精虧虛為本，還與外邪侵襲、勞損過度、外傷等有關。本病基本病因病機為虛、瘀、濕、熱，而精血虧虛、肝腎陰虛是發病的關鍵。病位在筋骨，與肝、腎密切相關。病性多為本虛標實，發作期以標實為主，緩解期以本虛為主。相對于西醫不同階段對癥施治來講，中醫藥[4~5]一般多采用綜合治療的方法來對骨性關節炎進行辨證施治，主要包括全身中成藥物治療為主，局部手法按摩、針灸、熏藥及功能鍛煉等為輔的多方法綜合治療體系，具有自己獨特的治療優勢。本院以往采用黃板樹根提取液治療慢性骨髓炎患者取得滿意療效，因黃板樹根為獨味中藥，費用低廉，且其作用機制鮮見報道。故本研究旨在通過對骨性關節炎患者使用黃板樹根提取液熏洗治療，并分別提取治療前后關節滑液，用ELISA法定量檢測治療前后滑液中炎性因子IL-18蛋白的表達水平，并比較其表達是否存在差異，明確黃板樹根提取液在OA中的作用及意義，為OA患者提供一種“簡、便、廉、驗”的臨床治療方法。

1　對象與方法

1.1研究對象OA滑膜標本主要取自南方醫科大學附屬南方醫院脊柱骨病科收治的髖膝關節OA行關節置換術患者，患者診斷均采用美國風濕病學會（ARA）2001年診斷標準，并排除其它疾病所導致的關節炎。正常關節滑膜標本取自創傷后截肢病人，所有取材均排除OA病史，術前均已告知患者，并取得患者知情同意；同時收集2013年6月~2014年12月在河源市中醫院骨傷科因膝關節骨性關節炎進行保守治療的患者30例，其中男17例，女13例，年齡41~85歲，平均（60.2±11.3）歲，分別抽取其治療前后的關節滑液。所有OA患者診斷標準采用美國風濕病學會于2001年提出的膝OA診斷標準，具體如下：臨床診斷+放射學標準：（1）前月大多數時間有膝痛；（2）骨贅形成；（3）年齡＜40歲；（4）晨僵時間＜30 min；（5）有骨摩擦音。滿足（1）+（2）條或（1）+（3）+（5）條，或（1）+（4）+（5）條者作為膝骨關節炎診斷，本研究得到所有對象的知情同意。

1.2主要試劑及器材黃板樹根提取液，EP管，離心管，倒置相差顯微鏡（Olympus），超凈工作臺，組織切片設備，人白細胞介素-18，ELISA Kit（Uscnlife Science & Technology Company，武漢中美科技有限公司進口組裝）。

1.3滑膜組織病理切片及HE染色

1.3.1組織病理切片法（1）取材：分別取OA滑膜組織及正?；そM織，組織塊大小為2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm；（2）組織固定：新鮮取材后，即刻以10%甲醛固定液固定組織塊12 h；（3）脫水透明：脫水步驟：80%、90%、95%、100%乙醇各2 h；透明步驟：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1.5 h；（4）浸蠟、包埋、切片。

1.3.2 HE染色法（1）貼片與烤片；（2）切片在二甲苯中脫蠟5~10 min；（3）移入二甲苯和純酒精（1∶1）混合液中5 min左右；（4）入100%、95%、85%、70%乙醇，各級為2~5 min，最后經蒸餾水轉入染液；（5）蘇木精染液染色5~15 min；（6）水洗玻片上多余染液，0.5%~1%鹽酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。鏡檢控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止，約數10 s；（7）流水沖洗15~30 min，或者在碳酸鋰飽和液中短時間堿化或藍化，即細胞核呈藍色；（8）蒸餾水短洗；（9）0.1%~0.5%伊紅染液染色1~5 min；（10）依次經70%、85%、95%、100%乙醇脫水各2~3 min；（11）二甲苯透明（2次），共約10 min；（12）封片及鏡檢：擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固，在光鏡下做病理學觀察。

1.4關節滑液中上清液收集對OA患者治療前抽取關節滑液3 ml，分別編號，并置于-20℃冰箱中備用；對OA患者經黃板樹根提取液熏洗1個療程（7 d）后，再分別抽取其關節滑液3 ml，對應編號，并置于-20℃冰箱中備用；

1.5酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測將-20℃保存的關節滑液放于冰盒完全解凍后，按ELISA檢測試劑盒說明操作：加樣，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100 μl，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120 min，棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100 μl，37℃，60 min。洗板3次，350 μl/每孔，甩干。每孔加檢測溶液B工作液100 μl，37℃，60 min洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色30 min（此時肉眼可見標準品的前3~4孔有明顯的梯度蘭色，后3~4孔梯度不明顯）。依序每孔加終止溶液50 μl，終止反應（此時蘭色立轉黃色）。用酶聯儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.6統計學處理采用SPSS13.0統計軟件，對黃板樹根提取液治療前后OA患者關節滑液中IL-18含量進行比較，采用方差不齊的t檢驗進行分析，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為有顯著性差異。

2　結果

2.1滑膜組織形態及病理切片觀察收取的OA滑膜組織與正?；そM織在外觀上差異不大，肉眼觀正常滑膜組織為瓷白色或淡粉色（圖1），而OA滑膜組織多為粉紅色（圖2）。病理切片HE染色顯示：相比正常滑膜組織（圖3），OA滑膜組織出現明顯的血管擴張和炎細胞浸潤（圖4箭頭所示），符合慢性炎癥表現。

2.2 ELISA法檢測關節滑液中IL-18含量根據酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），以及IL-18標準曲線（圖5），計算待測標本濃度。對OA患者黃板樹根提取液治療前后關節滑液IL-18含量進行檢測后進行統計學分析，t=8.052，P＜0.001，治療前后IL-18含量比較差異有統計學意義。見表1。

3　討論

骨性關節炎是中老年人中最常見的疾病。目前據世界衛生組織調查，OA的發病人口已占世界人口總數的10%左右，多數學者認為OA的發病是多因素的，雖然對于骨性關節炎的發病機理已有大量的研究報道，但目前學術界仍未有一個明確的共識；骨性關節炎的典型特征為骨贅的形成和軟骨下骨的硬化[6]。雖然骨性關節炎的發病也有一些易感因素，例如性別、肥胖，但是骨性關節炎最主要的易感因素是年齡[7]，Murphy等[8]研究顯示接近50%的成年人在85歲之前發展成有癥狀的骨性關節炎，這主要是隨著年齡逐漸增加，對關節軟骨有保護作用的蛋白多糖會逐漸減少，膠原纖維和糖化作用終末產物的交聯顯著增加，使這種老化軟骨變成更脆弱和易受損傷而關節結構受破壞[9~10]，但這些都是骨性關節炎病變的終末期表現，要想真正延緩和控制骨性關節炎的發病，還要從關節早期的微小病變研究做起。從目前對于骨性關節炎的研究情況表明，大多數學者在骨性關節炎早期的病變過程中均涉及滑膜炎這一病理改變，滑膜發生炎癥使其產生的滑液中釋放大量的細胞因子，其中部分細胞因子均有誘導炎癥發生發展的作用，目前研究較多的細胞因子主要有：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子、一氧化氮及前列腺素E2等，它們主要是通過直接起效、與其他炎性因子結合或通過其分解轉化的代謝產物發生炎性作用。

本研究先從收集的滑膜組織肉眼形態觀察及鏡下病理切片觀察兩個方面進行研究對比，收取的OA滑膜組織與正?；そM織在外觀上差異不大，肉眼觀正?；そM織為瓷白色或淡粉色，而OA滑膜組織多為粉紅色，病理組織切片HE染色顯示相比正?；そM織，OA滑膜組織中出現明顯的血管擴張和炎細胞浸潤，完全符合慢性炎癥的表現，OA滑膜組織肉眼觀察色澤較正常滑膜組織深，可能與其炎癥反應血管擴張及充血水腫有一定關系，這也在一定程度上證明了在OA滑膜組織中炎癥反應及炎性介質的參與。

IL-18是近年來研究學者新發現且越來越被重視的一種致炎因子，它具有多種生物學功能參與多種炎癥反應過程，且在不同的炎癥反應中發揮不同的生物學效應。IL-18最初是由國外研究學者從注射脂多糖的小鼠肝臟及熱滅活丙酸桿菌中提取一種能誘導Th1產生干擾素-γ的細胞因子[11]，它在結構上與IL-1相類似，但在功能上又與IL-12大近相同。目前有研究表明IL-18隸屬于IL-1家族，因為其在發揮生物學效應時的受體和轉導途徑與IL-1完全相同。有研究表明：在發揮炎癥效應方面，IL-18一方面可以通過協同IL-12一起發揮作用，然后誘導

表1　治療前后IL-18含量比較（pg/ml，x±s）

圖1　正常滑膜組織外觀像

圖2　OA滑膜組織外觀像

圖3　正?；そM織病理切片圖HE染色（×400）

圖4　OA滑膜組織病理切片圖HE染色（×400）

圖5　IL-18在關節滑液中的表達ELISA標準曲線

TNF-α的表達，而TNF-α已被研究證實對骨關節炎的發生和滑膜組織的增生發揮促進作用；另一方面，IL-18可以對關節軟骨細胞COX-2、iNOS等基因的表達產生直接刺激作用，從而誘導軟骨細胞產生大量炎性介質，如PGE2、NO等，從而參與關節的炎癥、損傷及退行性變等過程[12]。此外，在對類風濕性關節炎的研究過程中發現，類風濕性關節炎患者關節滑液和血清中IL-18表達水平較其他組織明顯增高，且在治療過程中通過試驗性使用IL-18結合蛋白及IL-18單克隆抗體進行治療，炎癥的發展可被明顯控制，上述研究表明IL-18可作為治療類風濕性關節炎的臨床療效和預后判斷的一個重要指標。有研究表明，在局部滑膜炎癥中IL-18表達能明顯提高和擴增TNF-α及IL-1β的表達水平，且在疾病的不同階段這種擴增效應不同，在炎癥急性期這種效應尤為明顯，這表明IL-18可能是骨關節炎起病及發生過程中最初的、主要的一種細胞因子[13~14]。

中醫中藥防治骨關節炎具有悠久歷史，并且其具有獨特的療效。膝骨關節炎屬中醫“痹證”范疇，基本病機特點為“本虛標實、虛實夾雜”，《素問·痹論》“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，感受風、寒、濕、之邪，使氣血運行不暢，經絡痹阻，而形成痹證。黃板樹根是在吸收河源民間療法的基礎上發掘的單方驗方，該藥性平，味甘微澀，長期臨床實踐和民間考察發現該藥具有活血止痛、祛風濕通經絡、清熱解毒等作用，《內經》中記載：“其有邪者，漬形以為汗”，故選用熏洗療法，局部吸收，直達病所，達到祛風除濕、活血止痛之效，能擴張血管，促進患處局部的血液循環，有利于炎癥介質吸收，以緩解疼痛，滑利關節，從而達到改善關節功能的作用[15]。因黃板樹根取自民間經驗方，目前對其研究報道僅見于其治療慢性骨髓炎的實驗研究[16]，對于其在骨性關節炎中所起的生物學機理有待課題組進一步研究。

本研究通過對OA患者使用黃板樹根提取液熏洗治療，并比較治療前后關節滑液中IL-18的表達水平，統計學顯示黃板樹根熏洗治療前后關節滑液中IL-18表達含量比較差異有統計學意義。這也從一方面證實了黃板樹根提取液熏洗治療后可以使OA關節滑液中炎性因子IL-18表達下調，能更直接地反映出黃板樹根提取液對于OA病變過程中炎性因子IL-18的表達有一定的干預控制作用，從而達到治療骨關節炎的作用。本研究期間未發生并發癥，說明黃板樹根提取液熏洗治療安全性高，價格低廉，效果確切，操作簡單，易于推廣。但因骨關節炎病理機制復雜，因此對黃板樹根提取液抑制IL-18表達治療骨關節炎的作用機制需做更進一步的研究，從而明確黃板樹根提取液消炎止痛的作用機制，為臨床治療OA提供更多理論依據。

參考文獻

[1]Hamerman D.Aging and osteoarthritis: basic mechanisms [J].J Am Geriatr Soc,1993,41(7):760-770

[2]Ushio S,Namba M,Okura T,et al.Cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor,expression in Escherichia coli,and studies on the biologic activities of the protein[J].Immunol,1996,156 (11):4274-4279

[3]張福強,吳明霞,劉獻祥,等.福州市中老年人骨性關節炎的性別和年齡分布[J].福建中醫學院學報,2009,19(1):43-46

[4]李西海,陳文列,劉獻祥.補腎柔肝法防治骨性關節炎作用機制探討[J].福建中醫藥大學學報,2011,21(2):66-69

[5]朱江偉,朱偉南,李銳鍵.補腎活血法防治關節軟骨退變的研究進展[J].廣東醫學,2010,31(3):389-391

[6]Loeser RF.Age-related changes in the musculoskeletal system and the development of osteoarthritis [J].Clin Geriatr Med,2010,26 (3): 371-386

[7]Zhang Y,Jordan JM.Epidemiology of osteoarthritis [J].Clin Geriatr Med,2010,26(3):355-369

[8]Murphy L,Schwartz TA,Helmick CG,et al.Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis [J].Arthritis Rheum,2008,59: 1207-1213

[9]Verzijl N,DeGroot J,Bank RA,et al.Age-related accumulation of the advanced glycation endproduct pentosidine in human articular cartilage aggrecan:the use of pentosidine levels as a quantitative measure of protein turnover[J].Matrix Biol,2001,20(7):409-417

[10]DeGroot J,Verzijl N,Wenting-van Wijk MJ,et al.Accumulation of advanced glycation end products as a molecular mechanism for aging as a risk factor in osteoarthritis [J].Arthritis Rheum,2004,50 (4): 1207-1215

[11]Okamura H,Tsintsi H,Komalsu T,et al.Cloning of a new cy- tokine that induces IFN-gamma production by T cells[J].Nature,1995,378 (6552):88-91

[12]Dai SM,Shan ZZ,Nishioka K,et al.Implication of interleukin-18 in production of matrix metalloproteinases in articular chondrocytes in arthritis:direct effect on chondrocytes may not be pivotal [J].Ann Rheum Dis,2005,64(5):735-742

[13]Joosten L,Radstake T,Lubberts E,et al.Association of inter-leukin-18 expression with enhanced levels of both interleukin-1 [beta] and tumor necrosis factor [alpha] in knee synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2003,48(2):339-347

[14]王鳳龍,江建明,肖軍,等.IL-18在骨性關節炎滑膜細胞中的表達及意義[J].中華風濕病學雜志,2010,14(4):260-262

[15]陳海東,王培民,范竟,等.膝骨關節炎外敷中藥方關聯規則的研究[J].中醫正骨,2012,24(1):32-34

[16]肖智青,張雄輝,朱錦忠,等.黃板樹根治療慢性骨髓炎的療效觀察[J].中國中醫骨傷科雜志,2011,11(19):17-18

The Expression and Significance of Huangban Tree Extract for IL-18 in Synovial Fluid of Patients with Osteoarthritis

WANG Feng-long1, XIAO Zhi-qing1, ZHU Jin-zhong1, WANG Ai-ming1, XU Zhou-fa1, ZHANG Huo-lin1, JIANG Jian-ming2

(1Heyuan hospital of Traditional Chinese Medicine of Guangdong Province, Heyuan517000;

2South Medical University Affiliated Nanfang Hospital, Guangzhou510515)

Abstract:Objective: To explore the expression and significance of Huangban tree extract for IL-18 in synovial fluid of patients with osteoarthritis (OA). Methods: Observed the open and pathological difference between normal synovium and OA synovium. Gathered the primary synovial fluid from OA patients (n=30), and then treated those patients with Huangban tree extract, taken the synovial fluid again after treatment, The concentrations of IL-18 were measured in human OA synovial fluid by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), compared the difference. Results: The normal synovium was light red or white porcelain, while the OA synovium was pink. The pathological section of synovium showed: compared to normal synovium, the OA synovium had evident hyperplasy in vessel and infiltrating by inflammatory factors. This was the character of chronic inflammation. The average value of IL-18 in OA before treatment was (52.625±11.336) pg/ml. The average value after treatment was (22.512±2.021) pg/ml. There was a significant statistics difference between them (P＜0.05). Conclusion: After the treatment of Huangban tree extract IL-18 is lower expressed in synovial fluid of OA patients, it may play an important role in the treatment of OA.

Key words:Osteoarthritis; Huangban tree extract; Interleukin 18; Synovial fluid

收稿日期：（2015-04-13）

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.09.001

文獻標識碼：B

中圖分類號：R684.3

*基金項目：國家自然科學基金（編號：30571890）