絲膠對Fas介導的糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的保護作用

絲膠對Fas介導的糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡的保護作用

劉東波魏萌張艷喬躍兵陳志宏

(承德醫學院，河北承德067000)

摘要〔〕目的觀察絲膠對2型糖尿病大鼠血糖、胰島形態結構、胰島細胞中胰島素及胰島β細胞細胞質死亡受體(Fas)表達的作用。方法48只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組、絲膠治療組，每組12只。采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病動物模型,成模后，絲膠治療組和二甲雙胍組大鼠分別給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃。給藥4 w后禁食12 h，麻醉后取血，全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖(FPG)；常規HE染色普通光鏡下觀察胰島的形態結構和免疫組織化學染色法觀察胰島細胞中胰島素表達情況；免疫組織化學染色法觀察胰島β細胞細胞質Fas蛋白的表達情況。結果①與正常對照組相比，模型組大鼠FPG明顯升高(P<0.01);與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組FPG明顯降低(P<0.01)；②與正常對照組相比，模型組胰島萎縮、輪廓欠圓潤、邊緣不規則，胰島細胞數量減少且分布稀疏而不均勻，胰島素表達水平下降(P<0.05)；與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組大鼠胰島細胞數量增多，分布也比較致密，胰島素表達水平上升(P<0.05)；③與正常對照組相比，模型組Fas蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組Fas蛋白的表達明顯升高(P<0.05)。以上指標絲膠治療組和二甲雙胍組比較均無明顯差異(P>0.05)。結論絲膠對2型糖尿病具有治療作用，其機制可能與抑制Fas介導的胰島β細胞凋亡有關。

關鍵詞〔〕2型糖尿病；絲膠；胰島素；Fas

中圖分類號〔〕R587〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河北省自然科學

通訊作者：喬躍兵(1965-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經內分泌方面研究。

第一作者：劉東波(1986-)，男，碩士，主要從事內分泌方面研究。

目前全球有糖尿病患者2.85億，中國糖尿病人群數量可占到全球的1/3，而其中90%以上為2型糖尿病〔1〕。2型糖尿病是遺傳和環境因素共同作用的多基因復雜性疾病，其病理機制為β細胞功能受損和胰島素抵抗，二者在2型糖尿病發生發展中到底誰是首要原因尚存在異議，最近的研究開始重視胰島β細胞功能受損在糖尿病病程發展中的作用〔2〕。胰島β細胞的數量決定分泌胰島素的多少，β細胞凋亡增加可造成β細胞數量減少，最終導致胰島素分泌不足和糖尿病〔3,4〕。最近的一項大規模尸檢發現，糖耐量受損和2型糖尿病患者均存在β細胞數量的明顯減少，2型糖尿病患者更為嚴重〔5〕。前期研究證明絲膠可通過上調抗凋亡基因Bcl-2表達和下調促凋亡基因Bax表達調節胰島β細胞凋亡、增殖的平衡〔6〕。本研究探討絲膠對糖尿病大鼠血糖、胰島形態結構、胰島細胞中胰島素和胰島β細胞凋亡相關蛋白Fas表達的影響。

1材料與方法

1.1藥物和試劑絲膠由彩色蠶繭經浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司，用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液；鹽酸二甲雙胍，遼寧一成藥業有限公司，臨用時研成細末用蒸餾水配成溶液；血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司；胰島素小鼠抗大鼠單克隆抗體、Fas兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實驗動物的分組及處理清潔級雄性SD大鼠48只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：712024。大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組、絲膠治療組，每組12只。采用小劑量鏈脲佐菌素(STZ，25 mg/kg)連續腹腔注射，連續3 d，1 w后以血糖為≥16.7 mmol/L作為成模標準，待成模后，絲膠治療組和二甲雙胍組分別給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)和二甲雙胍(55.33 mg·kg-1·d-1)灌胃，連續35 d；正常對照組和模型組不作處理。

1.3檢測血糖各組大鼠禁食12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經內眥于眶后靜脈叢采血，京立LD4-2A離心機3 000 r/min，離心20 min，收集血清，使用日本日立公司的Boehringer Mannhein/Hitachi全自動臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4胰島的形態學觀察大鼠取血后斷頭處死，取胰腺入Bouins液固定，常規石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm。常規HE染色，光學顯微鏡下觀察胰島形態結構的變化并攝片。免疫組化染色及定量分析：SP免疫組化染色法觀察胰島細胞中胰島素和胰島β細胞Fas蛋白的表達，一抗稀釋濃度胰島素為1∶150，Fas為1∶100，陰性對照加等量PBS，DAB顯色，蘇木素復染，以胞質出現棕黃色顆粒為陽性反應。定量分析：使用Image-pro plus 6.0圖像分析處理軟件，在10×20倍顯微鏡下隨機選取胰島作為觀察視野，計算陽性產物面積占胰島面積的比值；每組隨機選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個胰島，取平均值。

2結果

2.1各組大鼠血糖比較與正常對照組相比，模型組血糖顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，二甲雙胍和絲膠治療組血糖明顯降低(P<0.01)；二甲雙胍和絲膠治療組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別血糖胰島素β細胞正常對照組10.83±2.030.785±0.0630.150±0.016模型組二甲雙胍組29.45±4.821)13.18±2.303)0.524±0.0862)0.684±0.0534)0.515±0.0422)0.318±0.0234)絲膠治療組13.20±4.093)0.703±0.0344)0.359±0.0344)

與正常對照組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.01，4)P<0.05

2.2各組大鼠胰島的形態結構正常對照組胰島島形豐滿，輪廓清晰，到細胞分布緊密而均勻；模型組胰島萎縮，輪廓欠圓潤，邊緣不規則，胰島細胞數量減少且分布稀疏而不均勻；絲膠治療組和二甲雙胍組胰島細胞數量均增多，分布也比較致密，絲膠治療組與二甲雙胍組胰島形態變化差異不大。見圖1。

圖1　各組胰腺組織HE染色(×200)

2.3各組大鼠胰島細胞中胰島素的表達情況 光鏡下正常對照組大鼠胰島結構完整，比較飽滿，邊界清晰，胰島素陽性顆粒經染色后為棕色,在胰島中廣泛分布；模型組大鼠胰島縮小，邊界不清，胰島素表達水平下降(P<0.05)；二甲雙胍組和絲膠治療組大鼠胰島增大，邊界較清晰，胰島素表達較模型組升高(P<0.05)，二者之間比較無明顯差異。見圖2。

圖2　各組胰島細胞中胰島素表達情況(DAB，×200)

2.4各組大鼠胰島β細胞Fas蛋白的表達Fas蛋白免疫陽性產物為棕色，位于細胞質，免疫陽性細胞主要為胰島胰島β細胞。與正常對照組相比，模型組Fas表達明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，絲膠治療組和二甲雙胍組Fas表達減少(P<0.05)；絲膠治療組和二甲雙胍組比較無統計學意義(P>0.05)。見圖3，表1。

圖3　各組胰島β細胞細胞質Fas蛋白的表達(DAB，×200)

3討論

胰島β細胞凋亡造成的胰島數量不足和胰島功能受損在糖尿病的病程進展具有重要作用。如何保護殘存的胰島β細胞和減少凋亡來延緩糖尿病的進展，成為目前糖尿病研究的熱點和難點〔7～9〕。

胰島β細胞凋亡是一個非常復雜的生理和病理過程，是由自身內部機制調節的主動性、特定程序性的細胞自發性死亡方式。調控細胞凋亡的信號導通路主要有3條：死亡受體通路、線粒體通路及內質網通路〔10〕。最近研究顯示，Fas所引起的胰島β細胞凋亡是糖尿病的發病因素，屬于死亡受體途徑〔11,12〕。Fas與死亡受體配體(FasL)結合后傳遞細胞程序化死亡信息，產生有活性的半胱天冬蛋白酶(Caspase)-8，激發一系列Caspase下游的級聯反應，從而誘發細胞凋亡〔13〕。

本研究結果表明絲膠可通過降低血糖，下調凋亡蛋白Fas的表達，減少胰島細胞的凋亡，從而增加胰島細胞胰島素的表

達，使得相應的胰島細胞數量增加，在一定程度上恢復胰島的功能，因此絲膠對糖尿病具有一定的治療作用。絲膠為天然高分子水溶性蛋白，由18種氨基酸組成，約占繭絲的30%，在繅絲和精煉時大部分被丟棄。絲膠具有低毒或無毒，副作用比較少，可明顯促進胰島再生、改善胰島素抵抗且來源比較廣泛。本研究進一步探索了絲膠保護胰島細胞凋亡的內在機制，為充分利用絲膠提供了實驗依據。

4參考文獻

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〔2014-06-27修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)