低分子肝素對膿毒癥大鼠可溶性血栓調節蛋白、可溶性內皮細胞蛋白C受體及可溶性E-選擇素的影響

低分子肝素對膿毒癥大鼠可溶性血栓調節蛋白、可溶性內皮細胞蛋白C受體及可溶性E-選擇素的影響

崔雷程青虹1何永來1趙利曾建瓊1

(石河子大學醫學院，新疆石河子832002)

摘要〔〕目的探討低分子肝素對膿毒癥大鼠肺血管內皮細胞功能的影響。方法采用大鼠盲腸結扎穿孔術(CLP)復制大鼠膿毒癥模型。清潔級雄性Wistar大鼠104只被隨機分為正常對照組、假手術組、膿毒癥模型組和低分子肝素治療組，每組8只，其中后三組按術后處死時間分為12、24、48、72 h共4個亞組。各組分別在相應時間點處死大鼠，經腹主動脈取血進行常規檢測，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定可溶性血栓調節蛋白(sTM)、可溶性內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)濃度以及炎癥反應可溶性E-選擇素(sE-selectin)的含量。結果正常對照組和假手術組sTM、sEPCR和sE-selectin的表達水平均無顯著差異(P均>0.05)。膿毒癥模型組傷后12 h開始在各個時間點sTM、sEPCR和sE-selectin的表達均有不同程度增高(P均<0.05)，并持續至傷后72 h；與模型組比較，低分子肝素治療組于CLP后12 h開始，至24、48 h，sTM、sEPCR和sE-selectin的表達均明顯降低，并持續至72 h(P均<0.05)。結論低分子肝素能通過對膿毒癥凝血-炎癥網絡的調節，降低膿毒癥大鼠sTM的表達水平，并降低大鼠體內sE-selectin的水平，從而減輕肺組織炎癥損害，在一定程度上緩解膿毒癥的進程。

關鍵詞〔〕膿毒癥；低分子肝素；可溶性血栓調節蛋白；可溶性內皮細胞蛋白C受體；可溶性E-選擇素

中圖分類號〔〕R631〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160017)

通訊作者：程青虹(1967-)，男，主任醫師，碩士，主要從事重癥醫學研究。

1石河子大學醫學院第一附屬醫院重癥醫學二科

第一作者：崔雷(1985-)，男，住院醫師，在讀博士，主要從事重癥醫學研究。

Effect of the low-dose heparin on STM and sE-selectin in septic rats

CUI Lei,CHENG Qing-Hong,HE Yong-Lai,etal.

Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832002,Xinjiang,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of low-dose heparin injection on pulmonary vascular endothelial cell function of sepsis rats.MethodsSepsis model was produced by cecal ligation and puncture(CLP). 104 healthy male Wistar rats were randomly divided into control,sham operation,cecal ligation and puncture(CLP) model group,and low-dose heparin-treated groups. The three latter groups were divided into four subgroups of 12,24,48 and 72 h with 8 rats in each subgroup. The blood samples of each group were collected at various time points from abdominal aorta to determine the levels of sTM,sEPCR and sE-selectin expression by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe levels of STM,sEPCR and sE-selectin expressions had no significant differences among control and sham operation groups(both P>0.05). STM,sEPCR and sE-selectin expressions levels were significantly increased beginning at 12 h in post-CLP(all P<0.05),and were decreased continuing at 72 h. Also,low-dose heparin dramatically decreased STM,sEPCR and sE-selectin levels at 12 h,and markedly decreased at 48 and 72 h compared with those of model group(all P<0.05).ConclusionsLow molecular heparin could pass to sepsis coagulation-inflammation network adjustment,reduce the expression levels of sTM and sE-selectin in sepsis rats so as to reduce the inflammation of lung tissue damage,and it could obviously alleviate the development of sepsis at a certain extent.

【Key words】Sepsis;Low-dose heparin;sTM;sEPCR;sE-selectin

異常的凝血系統和炎癥反應在膿毒癥發生發展過程中起到重要作用，是膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)發生的重要機制之一；且膿毒癥與急性肺損傷的病理生理過程類似，都包括由宿主失控的防御反應引起炎癥、內皮細胞損傷、促凝活性加強及纖溶活性下降等〔1〕。肝素可激活抗凝血酶發揮抗凝作用，在膿毒癥治療領域逐漸凸顯其應用潛力。低分子肝素(LMWH) 是經肝素降解所得的低分子量片段或經分級法得到的4 000～6 500 D低分子量組分。該組分具有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等作用，具有生物利用度高、血漿半衰期長、出血副作用少等特點，現已成為肝素類藥物研究的焦點〔2〕。本實驗采用盲腸結扎穿孔術(CLP)復制大鼠腹腔感染的膿毒癥模型，研究LMWH對膿毒癥大鼠肺血管內皮細胞功能的影響，探討LMWH在膿毒癥防治方面的可能機制。

1材料與方法

1.1材料清潔級雄性Wistar大鼠104只，體重220～260 g，購自新疆醫科大學醫學動物中心。正式實驗前適應性喂養2 w。低分子肝素鈉注射液(1 ml：2 500 IU)，杭州九源基因工程有限公司；酶聯雙抗體夾心ELISA試劑盒，美國Gene May有限公司；TECAN DNA export酶標儀，TECAN公司；FRESCO臺式低溫離心機，賀利氏公司。

1.2動物分組及處理因素隨機分為正常對照組、假手術組、膿毒癥模型組(CLP)和LMWH組，后三組再分為術后12、24、48和72 h組，每組8只。麻醉后開腹，假手術組僅翻動盲腸，LMWH組經CLP術后立即皮下注射LMWH鈉注射液(100 U/kg)，CLP組行盲腸結扎術并穿孔，并注射等量生理鹽水。注射LMWH后在每個時間點每組采血，處死大鼠并取肺組織。應用ELISA法測定血清可溶性血栓調節蛋白(sTM)、可溶性內皮細胞蛋白C受體(sEPCR)以及可溶性E-選擇素濃度。

1.3動物模型制備按照Chaudry等〔3〕的方法行CLP，復制嚴重腹腔感染致膿毒癥模型。

1.4指標的檢測方法采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法原理定量測定，嚴格按照試劑盒說明書進行測定。

1.5統計學方法應用SPSS17.0軟件行方差分析。

2結果

2.1LMWH對膿毒癥大鼠sTM的影響假手術組與正常對照組比較無統計學差異(P>0.05)；與正常對照組和假手術組相比CLP組和LMWH組中sTM在各時間段的表達水平均顯著升高(P均<0.01)；但與CLP組相比，LMWH組大鼠sTM表達量在各個時間點均有所下降，12 h顯著下降，并持續下降至72 h(P均<0.01)。見表1。

2.2LMWH對膿毒癥大鼠sEPCR的影響正常對照組和假手術組在各時間點的sEPCR含量無差異(P均>0.05)；而CLP組和LMWH治療組sEPCR含量均顯著高于正常對照組和假手術組(P<0.05)。與CLP組比較，LMWH治療后的sEPCR含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3LMWH對膿毒癥大鼠sE-selectin的影響正常對照組和假手術組各時點sE-selectin無差異(P均>0.05)；與正常對照組和假手術組相比較，CLP后12 h內sE-selectin開始上升，隨時間延長，sE-selectin含量呈逐漸上調的趨勢，24 h達高峰，且持續至傷后72 h(P均<0.05)。而與CLP組比較，LMWH組sE-selectin表達較CLP后12 h有所下降，于術后24 h進一步降低，持續至72 h(P均<0.05)。見表3。

組別正常對照組假手術組CLP組LMWH組12h20.8±4.321.9±3.930.6±5.11)23.4±3.41)2)24h21.6±3.820.8±4.153.6±7.11)41.5±4.21)2)48h22.6±4.122.0±4.276.2±9.21)41.9±5.11)2)72h21.9±4.021.9±4.177.8±9.41)39.6±4.61)2)

與對照組比較：1)P<0.05；與CLP組比較：2)P<0.05；下表同

組別正常對照組假手術組CLP組LMWH組12h116.2±5.7117.3±6.0165.3±9.61)155.2±8.91)2)24h117.3±6.0118.0±5.7163.2±8.71)150.3±7.61)2)48h115.8±6.1119.6±6.2169.1±9.01)146.0±6.71)2)72h118.0±6.3118.3±5.9161.3±7.61)132.6±6.41)2)

組別正常對照組假手術組CLP組LMWH組12h11.6±1.010.1±1.222.3±3.21)15.3±2.11)2)24h10.4±1.211.7±0.950.9±3.01)21.4±2.81)2)48h12.8±0.911.0±1.051.6±2.51)30.2±2.31)2)72h10.5±1.111.2±1.146.9±3.11)25.6±2.21)2)

3討論

機體發生膿毒癥時，炎癥細胞過度激活，可通過各種途徑激活凝血系統，隨即機體產生抗凝物質并啟動纖溶系統。同時，纖溶系統及生理性抗凝系統受到不同程度地抑制，血液處于高凝狀態，微血管內微血栓大量形成，從而微循環障礙〔4〕。隨后，人們逐步認識到膿毒癥是炎癥反應，是凝血/纖溶系統障礙及免疫功能紊亂等眾多因素相互影響、相互作用的結果。

Cornet等〔5〕曾指出肝素(類肝素樣物質)可能發揮與活化蛋白C相同的抗凝及抗炎作用，且肝素價格便宜，易獲取。有研究〔6〕報道LMWH除具有抗凝作用外，另外還具有抗血栓這一重要作用。由于凝血酶的激活是血栓形成的主要原因之一，而LMWH具有較強抗FXa作用，因此能夠抑制凝血酶的激活；LMWH還具有抑制血小板聚集〔7〕、降低血液黏度、改變血液流變特性、維持血液正常的流動等作用。以上特性說明低分子肝素具有抗血栓作用。曹蘋等〔8〕結果表明LMWH對凝血系統的作用低于普通肝素(UFH)，而其抗血栓作用大于UFH。

血管內皮細胞在對抗血小板聚集、維持血管壁完整性等方面均具有重要的意義，并且還參與調節纖溶過程。E-selectin作為內皮細胞合成的一種表面糖蛋白，是細胞黏附分子選擇素家族成員之一，不僅能夠介導白細胞在血管內皮表面的運動，還與腫瘤細胞的轉移有著密切的聯系〔9〕。由于正常組織中的內皮細胞一般不表達E-selectin，只有當內皮細胞受到某些細胞因子刺激而被激活時才表達，因此E-selectin表達水平可在一定程度上反映癌癥的病理進展及轉移情況。E-selectin屬于黏附分子選擇素家族，主要表達于活化的內皮細胞與多種腫瘤患者內皮細胞表面，釋放入血后成為sE-selectin，檢測sE-selectin水平也可判定膿毒癥病變程度和病情，具有十分重要的臨床價值。同時，sE-selectin可作為機體炎癥反應的標志物之一，本次研究結果顯示，膿毒癥組sTM從12 h開始逐漸升高，48 h達到高峰；應用LMWH治療后內的sTM表達含量明顯下降，這可能與相關研究認為血清sE-selectin水平可反映血管內皮細胞的活化狀態〔10〕，與多種疾病病情的發生、發展有關。

TM作為蛋白C(PC)系統的重要組成部分，具有抗血栓形成、纖溶及抗炎等特性，可改善微循環、減緩器官功能障礙，在膿毒癥發病機制中起著重要作用。當內皮細胞受損時，TM脫落進入血液，導致STM升高。本研究表明LMWH可以有效地降低膿毒癥內皮細胞的損失，促進血管內皮細胞的改善。

本研究結果表明，LMWH可以減輕膿毒癥小鼠的炎癥反應，有效地發揮抗血栓、抗凝血及抗炎等作用，通過對膿毒癥凝血-炎癥網絡的調節，從而減輕肺組織炎癥損害，且在一定程度上緩解膿毒癥的發生發展，提示LMWH具有臨床治療膿毒癥、減輕內皮細胞損傷的應用潛力。但血管內皮細胞與其他炎癥細胞在發生膿毒癥中的關系還有待于進一步研究。

4參考文獻

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3Chaudry IH，Wichterman KA，Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels〔J〕.Surgery，1979;85(2)：205-11.

4Bauer I，Bauer M，Raddatz A，etal.Influence of gender on stimulated cytokine response in patients with severe sepsis〔J〕.Anaesthesist，2006;55(5)：515-27.

5Cornet AD，Smit EG，Beishuizen A，etal.The role of heparin and allied compounds in the treatment of sepsis〔J〕.Thromb Haemost，2007;98(3)：579-86.

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〔2014-11-19修回〕

(編輯袁左鳴)