斑蝥酸鈉維生素B6對人卵巢癌細胞株SKOV3的增殖抑制作用

斑蝥酸鈉維生素B6對人卵巢癌細胞株SKOV3 的增殖抑制作用

關永紅祁盛昆1劉賢英

(吉林大學第二醫(yī)院，吉林長春130041)

摘要〔〕目的觀察斑蝥酸鈉維生素B6對體外培養(yǎng)的人卵巢癌細胞株(SKOV3細胞)的增殖抑制率、凋亡率及其對細胞周期的影響。方法應用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6對SKOV3細胞的增殖抑制率。流式細胞儀定量檢測經(jīng)斑蝥酸鈉維生素B6作用后的SKOV3細胞周期進程的變化及凋亡率。結果不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性。流式細胞儀結果顯示G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，SKOV3細胞凋亡率升高。結論斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細胞生長增殖有顯著的抑制作用,抑制SKOV3細胞G1期向S期轉化進程，從而使S期細胞減少，造成G2/M期細胞相對增多，誘導SKOV3細胞凋亡。

關鍵詞〔〕SKOV3細胞；斑蝥酸鈉；細胞周期；凋亡

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：劉賢英(1966-)，女，副主任護師，主要從事婦科腫瘤研究。

1吉林大學臨床醫(yī)學院2012級

第一作者：關永紅(1966-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

卵巢癌是因早期缺乏特異性的診斷指標，當患者出現(xiàn)癥狀和體征時往往已進展到晚期。因此，尋求卵巢癌治療的有效藥物具有重要意義。斑蝥酸鈉系斑蝥的主要抗腫瘤活性成分——斑蝥素的半合成衍生物〔1〕，用于中晚期肝癌、胃癌、腎癌及宮頸癌等治療，獲得較為滿意的結果。本研究應用人卵巢癌細胞株(SKOV3)為靶點，體外觀察不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細胞增殖抑制率及細胞周期進程的變化，旨在為人卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料SKOV3細胞株購于上海復旦大學細胞庫，四甲基偶氮唑藍(MTT試劑)RPMI1640培養(yǎng)基購于美國sigma公司，斑蝥酸鈉維生素B6注射液10 ml/支，內(nèi)含斑蝥酸鈉0.1 mg，維生素B6 25 mg，貴州柏強制藥有限公司生產(chǎn)，胎牛血清購自長春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，應用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)細胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔靜止培養(yǎng)。當細胞生長達到80%匯合時，按加入斑蝥酸鈉濃度分為0 μg/ml組(對照組)、1.0 μg/ml組、20 μg/ml組、4.0 μg/ml及8.0 μg/ml，每個濃度10復孔，置37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)24 h，結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，棄去上清，每孔內(nèi)加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩5 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解。應用酶標儀于570 nm處測定各孔吸光度A值，計算SKOV3細胞增殖抑制率，每組試驗重復3次，取平均值。SKOV3細胞抑制率=(1-加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%。

1.2.2流式細胞術細胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進行。每個濃度3瓶，培養(yǎng)結束后用0.25%胰白蛋白酶消化，收集細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70% 冷乙醇固定，4℃內(nèi)保存。上機前過40目網(wǎng)，調(diào)細胞數(shù)1×106/ml,PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期，結果以Moidff2.0軟件分析。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS11.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1MTT結果不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6對SKOV3細胞增殖均有影響，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；其中對照組A值1.36；1 μg/ml組A值1.24，抑制率8.9%；2 μg/ml組A值1.11，抑制率18.4%；4 μg/ml組分別為0.89，34.6%；8 μg/ml組為0.82，39.7%。

2.2流式細胞儀結果不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3 細胞周期進程均有影響，G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，細胞凋亡率升高，組間比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1　不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細胞

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，人們已認識到惡性腫瘤的本質(zhì)在于細胞周期的調(diào)節(jié)失控，使本來應脫離細胞周期而停止增殖或應自行凋亡的細胞不斷地進入細胞周期，從而出現(xiàn)無限制、自主的細胞增殖和分裂，最終導致腫瘤〔2〕。 斑蝥酸鈉維生素B6是一種廣譜的抗癌新藥〔3〕，是斑蝥素的衍生物，他保持了斑蝥素特有的抗癌活性，而毒副作用比斑蝥素小，其抗癌機制是抑制腫瘤細胞蛋白質(zhì)的合成，降低腫瘤細胞CAMP的活性，抑制腫瘤DNA、RNA及前體的滲入，從而使腫瘤細胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變〔4〕。

流式細胞儀結果顯示，不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6制劑對SKOV3細胞周期各時相進程均有影響。細胞周期是由G1、S、G2/M期所組成的一個復雜過程，其進程受各種細胞因子的嚴格控制，其中任何一個環(huán)節(jié)失控即可發(fā)生形態(tài)學改變，實驗結果顯示，斑蝥酸鈉維生素B6制劑可阻滯SKOV3細胞G1期向S期轉化進程，G1期細胞堆積，不能進入S期，造成G1期細胞增多，G1期細胞是制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體，而且G1期糖原合成最為顯著。同時G1期也是化學藥物作用的敏感點〔5〕，因此，抑制細胞G1期的RNA合成，從而使腫瘤細胞增殖變緩。本研究結果顯示由于G1期細胞堆積，造成S期細胞減少，從而使G2/M期細胞相對增多。G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映〔6〕,這一點從細胞形態(tài)學和細胞凋亡率上得到了體現(xiàn)。

綜上所述，斑蝥酸鈉維生素B6作為抗癌藥物，不僅能直接抑制腫瘤細胞生長和增殖。也可通過抑制腫瘤細胞周期進程的變化，實現(xiàn)腫瘤細胞逆轉，且隨著藥物濃度增加和時間的延長抑制作用明顯，呈時間一劑量依賴關系，但斑蝥酸鈉的抗腫瘤的機制是多方面的，有待進一步研究。

4參考文獻

1劉展華，曹洋，陳銳深，等.斑蝥酸鈉對人肺癌LAC細胞增殖的抑制作用〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2008；19(1)：32-3.

2趙珍珍,李俊,王維剛,等.不同癌細胞系對斑蝥酸鈉的藥物敏感性檢測〔J〕.同濟大學學報(醫(yī)學版)，2013;34(4)：10-5.

3劉忠虎,陳艾江,馬新剛,等.斑蝥酸鈉維生素B6注射液輔以胸腔鏡內(nèi)臟神經(jīng)切斷術治療癌腹痛〔J〕.國際腫瘤學雜志，2013;40(5)：398-9.

4Murthy SC,Mason DP，Raja S，etal. Malignant pleural effusion:one size does not fit all〔J〕.Ann Thorac Surg,2013;96(4):1525-6.

5Brted J,Ludas J.Mammalian G1and S-phase checkpoints in reponse to DNA damage 〔J〕.J Curr Opin Cell Biol,2001;13(6):734-47.

6Eillnger Ziegelbauer H,Karasuyama H,Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK),a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells,2000;5(6):491-8.

〔2014-05-17修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)