莪術(shù)多糖對(duì)Lewis肺癌小鼠的抑制作用及機(jī)制

莪術(shù)多糖對(duì)Lewis肺癌小鼠的抑制作用及機(jī)制

陳志強(qiáng)張英志

(桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院呼吸科,浙江桐鄉(xiāng)314500)

摘要〔〕目的探討莪術(shù)多糖(CZP)對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用及可能機(jī)制。方法5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測(cè)CZP對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，中性紅比色法檢測(cè)CZP對(duì)小鼠脾巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響；建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，檢測(cè)CZP對(duì)Lewis 肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)、臟器指數(shù)及細(xì)胞免疫因子的影響。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)表明，CZP對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞吞噬活性(P<0.05或P<0.01)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，CZP對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤率分別為26.9%、31.9%和39.7%，荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、白細(xì)胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ水平均顯著提高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論CZP對(duì)小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能，通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)有效的抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)功能。

關(guān)鍵詞〔〕莪術(shù)多糖；Lewis肺癌；免疫功能

中圖分類號(hào)〔〕R734〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：嘉興市科技局項(xiàng)目(2012AY1070-1)

通訊作者：張英志(1984-)，男，主治醫(yī)師，主要從事肺癌放化療研究。

第一作者：陳志強(qiáng)(1975-)，男，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究。

莪術(shù)為姜科姜黃屬多年生草本植物，為傳統(tǒng)中藥材之一，應(yīng)用歷史悠久，具有抗腫瘤、抗菌、保肝、升高白細(xì)胞等作用〔1〕。莪術(shù)中的主要活性成分包括莪術(shù)油、莪術(shù)醇等〔2，3〕，而關(guān)于莪術(shù)多糖(CZP)的研究報(bào)道較少。鑒于已有大量關(guān)于植物多糖具有抗腫瘤活性的報(bào)道〔4〕，本文以莪術(shù)的水溶性成分CZP為研究對(duì)象，開展對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用及機(jī)制的相關(guān)研究，為后續(xù)的藥物研發(fā)奠定相關(guān)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試藥CZP為本實(shí)驗(yàn)室自制；環(huán)磷酰胺、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和胎牛血清購(gòu)制美國(guó)Sigma公司；白細(xì)胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(IFN)-γ測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2瘤株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)ewis肺癌細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；6~8周齡C57BL/6J小鼠，體重(20.0±2.0)g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3方法

1.3.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖用DMEM/F12培養(yǎng)液(10%小牛血清)培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰蛋白酶(0.25%)消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ml，接種于96孔板中，每孔體積為100 μl，設(shè)對(duì)照組，環(huán)磷酰胺(CTX，25 μg/ml)組，50、100、200 μg/ml CZP給藥組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，于每孔內(nèi)加5 mg/ml的MTT溶液15 μl，混勻后繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加DMSO 150 μl，混勻后用酶標(biāo)儀測(cè)492 nm處吸光度(A)值，計(jì)算抑制率。

1.3.2MTT法檢測(cè)CZP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響采用常規(guī)方法制備C57BL/6J小鼠脾淋巴細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組、50、100、200 μg/ml CZP給藥組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，5 μg/ml Con A和10 μg/ml LPS組，其他步驟同上，培養(yǎng)48 h，MTT法測(cè)492 nm處A值，計(jì)算相對(duì)增殖率。

1.3.3吞噬中性紅法測(cè)定小鼠脾巨噬細(xì)胞活性常規(guī)方法制備正常C57BL/6J小鼠脾巨噬細(xì)胞，RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/孔，加入96孔板中，每孔100 μl。設(shè)對(duì)照組、50、100、200 μg/ml CZP給藥組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，終體積為每孔200 μl。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔吸棄100 μl上清，然后加入中性紅溶液100 μl，培養(yǎng)30 min，離心，棄上清，用PBS洗3次，加200 μl裂解液室溫過(guò)夜，測(cè)589 nm處A值，計(jì)算吞噬率。

1.3.4體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)取接種14 d、生長(zhǎng)良好的Lewis肺癌細(xì)胞，在冰浴條件下以生理鹽水稀釋成1×107/ml的細(xì)胞懸液，以每只0.2 ml細(xì)胞懸液接種于小鼠右腋皮下。隨機(jī)分為對(duì)照組，CTX 25 mg/kg組，CZP低、中、高劑量(50、100、200 mg/kg)組，每組8只，雌雄各半。CZP以生理鹽水作為溶劑，每天腹腔注射1次，注射劑量均為0.2 ml，連續(xù)給藥21 d。末次給藥24 h后，稱小鼠體質(zhì)量，眼球取血，制備血清，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ｎi椎脫臼處死小鼠，取脾臟、肺臟、腎臟及瘤塊，計(jì)算脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肺臟指數(shù)及抑瘤率。

1.3.5酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)小鼠血清中免疫分子水平按照商品化的試劑盒說(shuō)明書中的操作步驟，采用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ含量。

2結(jié)果

2.1CZP對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響各劑量組對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用(P0.01)，且具有劑量依賴效應(yīng)；同時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用明顯增強(qiáng)，具有時(shí)間依賴效應(yīng)。見圖1。

2.2CZP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響與對(duì)照組相比，CZP各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性均顯著增高(P<0.05或P<0.01)，而與Con A組和LPS組無(wú)顯著差異(P>0.05)；CZP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性有促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05或P<0.01)，見表1。

2.3CZP對(duì)荷瘤小鼠脾臟、腎臟、肺臟指數(shù)的影響CTX可以顯著降低荷瘤小鼠脾臟指數(shù)(P<0.05)，而低、中、高劑量的CZP均可以顯著提升荷瘤小鼠脾臟指數(shù)(P<0.05 或P<0.01)；而無(wú)論是CTX還是CZP給藥組，對(duì)荷瘤小鼠腎臟及肺臟指數(shù)均無(wú)顯著性影響(P>0.05)。見圖2。

與對(duì)照組比較：1)P<0.01，表2同 圖1　CZP對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響(x-±s，n=3)

組別劑量(μg/ml) 脾淋巴細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 吸光度(A)淋巴細(xì)胞增殖率(%)吸光度(A)巨噬細(xì)胞吞噬率(%)對(duì)照組-1.01±0.11100.00.53±0.04100.0CZP組501.13±0.09118.81)0.66±0.05124.51)1001.37±0.08135.62)0.82±0.09154.72)2001.55±0.17152.52)0.95±0.13179.22)ConA組51.76±0.13174.22)--LPS組101.59±0.12157.42)--

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；圖2同

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01 圖2　CZP對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和 肺臟指數(shù)的影響(x-±s，n=8)

2.4CZP對(duì)小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)的影響CTX對(duì)小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)的抑制作用最為明顯，抑制率高達(dá)61.4%；各劑量組的CZP對(duì)Lewis肺癌的生長(zhǎng)也具有明顯的抑制，抑制率分別為26.9%、31.9%和39.7%，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。

2.5CZP對(duì)荷瘤小鼠血清免疫因子的影響與對(duì)照組相比，CTX組小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平與對(duì)照組比較顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。而低、中、高劑量的CZP均可顯提升IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平(P<0.01)，見表2。

表2CZP對(duì)Lewis荷瘤小鼠血清免疫因子的影響

組別劑量(mg/kg)IL-2TNF-αIFN-γ對(duì)照組-94.53±9.7359.83±8.0211.44±1.68CTX2541.29±7.051)41.27±6.841)5.32±0.911)CZP5098.75±13.191)73.14±9.951)16.46±2.281)100129.64±13.721)92.37±10.261)19.72±2.121)200145.93±15.371)129.72±11.891)21.29±1.351)

3討論

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康和生命，其發(fā)病率和死亡率在許多國(guó)家和地區(qū)均高居首位。近年來(lái)，隨著抗腫瘤新藥的不斷涌現(xiàn)，使腫瘤化療同放療和手術(shù)治療一樣，成為治療腫瘤的重要手段之一〔5〕。但現(xiàn)有的化療藥物對(duì)大多數(shù)實(shí)體瘤的療效不甚理想，加之在應(yīng)用過(guò)程中伴隨著耐藥性和較嚴(yán)重的副作用，使得研究人員迫切希望找到低毒、高效的抗腫瘤藥物。鑒于中醫(yī)藥在治療癌癥方面有其獨(dú)到之處，從傳統(tǒng)中藥材中篩選抗腫瘤活性成分以及抗腫瘤先導(dǎo)化合物已成為該領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)〔6〕。目前，來(lái)源于植物藥的抗癌制劑已占總抗癌藥物的30%以上，其中紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、喜樹堿等已成為許多腫瘤化療的首選藥〔7〕。我國(guó)藥用植物資源極為豐富，從傳統(tǒng)中藥中篩選抗腫瘤有效成分，并明確其抗腫瘤作用及機(jī)制，對(duì)于抗腫瘤藥物的開發(fā)具有非常重要的意義。

植物多糖的抗腫瘤作用與免疫功能的改善密切相關(guān)〔8〕。采用MTT及吞噬中性紅法分別檢測(cè)CZP對(duì)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響，發(fā)現(xiàn)CZP具有增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞吞噬活性的作用；同時(shí)，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，CZP具有增加荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的作用。腫瘤發(fā)生時(shí)，在分子水平上機(jī)體內(nèi)IL-2、TNF-α及IFN-γ等免疫因子表達(dá)增多，從而提高免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。IL-2是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要成員，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂、增強(qiáng)對(duì)殺傷細(xì)胞的殺傷作用和輔助抗體生成等生物學(xué)功能〔9〕。TNF-α是來(lái)源于活化的單核細(xì)胞，具有凋亡、壞死、激活淋巴細(xì)胞因子等各種抗腫瘤活性；同時(shí)，TNF-α可以與IL-2等相互作用從而發(fā)揮一系列的免疫作用〔10〕。IFN-γ是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞因子，作用于免疫系統(tǒng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，其作用主要為激活巨噬細(xì)胞和上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的表達(dá)〔11〕。本研究結(jié)果表明CZP可以通過(guò)提高免疫因子水平從而起到抑制Lewis肺癌的作用。

綜上所述，CZP對(duì)小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能，通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)有效的抗腫瘤作用和免疫調(diào)節(jié)功能。因此，CZP在未來(lái)有望作為一種低毒、高效的抗腫瘤成分，與一些化療藥物合用以提高患者的生活質(zhì)量，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)4

1曾建紅，黃慶龍，陳旭，等.莪術(shù)抗癌活性成分的研究進(jìn)展〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2008；23(5)：426-8.

2梁莉萍，賈存東.莪術(shù)油對(duì)乳腺癌癌前病變大鼠的治療效果及作用機(jī)制〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(12)：2821-3.

3王耀霞，徐立春.莪術(shù)醇抗腫瘤研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2009；15(22)：3483-6.

4林俊，李萍，陳靠山.近5年多糖抗腫瘤活性研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2013；38(8)：1116-25.

5Zeremski V，Savic A.Post-remission therapy of adult acute myeloid leukemia：high dose cytosine-arabinoside versus other consolidation regimens〔J〕.Med Pregl，2014；67(3-4)：83-90.

6徐珊，徐昌芬.腫瘤多藥耐藥性發(fā)生機(jī)制及中藥逆轉(zhuǎn)作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2006；13(6)：400-11.

7Ando M，Yonemori K，Katsumata N，etal.Phase I and pharmacokinetic study of nab-paclitaxel，nanoparticle albumin-bound paclitaxel，administered weekly to Japanese patients with solid tumors and metastatic breast cancer〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2012；69(2)：457-65.

8Cai ZB，Li W，Wang HT，etal.Antitumor effects of a purified polysaccharide from Rhodiola rosea and its action mechanism〔J〕.Carbohyd Polym，2012；90(1)：296-300.

9Rosenberg SA.IL-2：The first effective immunotherapy for human cancer〔J〕.J Immunol，2014；192(12)：5451-8.

10Alokail MS，Al-Daghri NM，Mohammed AK，etal.Increased TNF α，IL-6 and ErbB2 mRNA expression in peripheral blood leukocytes from breast cancer patients〔J〕.Med Oncol，2014；31(8)：38.

11Gerber SA，Sedlacek AL，Cron KR，etal.IFN-γ mediates the antitumor effects of radiation therapy in a murine colon tumor〔J〕.Am J Pathol，2013；182(6)：2345-54.

〔2013-10-10修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)