EGCG對刀豆蛋白A誘導(dǎo)肝損傷小鼠CXCR3表達(dá)的影響

EGCG對刀豆蛋白A誘導(dǎo)肝損傷小鼠CXCR3表達(dá)的影響

劉冬梅張晶孫玥

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，遼寧沈陽110004)

摘要〔〕目的觀察EGCG對刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝組織中CXCR3表達(dá)的影響。方法C57BL/6小鼠分成4組：正常對照組、表沒食子兒茶素酸酯(EGCG)對照組、ConA模型組，EGCG+ConA模型組。EGCG對照組及EGCG+ConA模型組小鼠造模前給予EGCG口服(5 mg/kg)，10 d后兩組模型組小鼠通過靜脈注射ConA(15 mg/kg)建造肝損傷模型，采血及留取肝組織，HE法檢測肝組織病理變化，ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF)α，干擾素(IFN)-γ及CXCR3的水平，免疫組化法檢測肝組織中CXCR3的表達(dá)。結(jié)果ConA模型組小鼠肝損傷明顯，TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表達(dá)明顯增多，與其他組比較有差異顯著(P<0.05)；EGCG干預(yù)的模型組肝損傷減輕伴TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表達(dá)下降，與ConA模型組比較差異明顯(P<0.05)。免疫組化結(jié)果同樣顯示ConA模型組CXCR3的表達(dá)明顯增多，EGCG治療后表達(dá)減少。結(jié)論EGCG對ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷小鼠有保護(hù)作用，其機制可能與調(diào)節(jié)CXCR3的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕EGCG；刀豆蛋白A；肝損傷；CXCR3

中圖分類號〔〕R575.1〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

第一作者：劉冬梅(1975-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事自身免疫性疾病研究。

植物凝集素刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的實驗小鼠肝損傷模型與人類自身免疫性肝炎(AIH)及病毒性肝炎類似，以肝臟聚集CD4+T細(xì)胞為主，介導(dǎo)了肝臟的免疫性損傷〔1〕。近年來，趨化因子受體及其家族在炎性疾病中的作用越來越受到人們的關(guān)注，其中CXCR3是一類較具代表性的趨化因子。有研究發(fā)現(xiàn)，許多慢性肝臟疾病中CXCR3相關(guān)配體CXCL10顯著升高。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從綠茶中提取的一種多酚化合物。研究表明EGCG具有抗炎、抗氧化、抗癌等諸多藥理活性，最近有結(jié)果顯示， EGCG能夠通過抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)減輕ConA誘導(dǎo)的急性肝損傷，但其具體的作用機制并不明了〔2〕。本實驗采用靜脈注射ConA誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立肝損傷動物模型，給予EGCG進(jìn)行干預(yù)，觀察EGCG對小鼠的肝保護(hù)作用及對肝組織中CXCR3表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物與主要試劑C57BL/6小鼠(中國醫(yī)科大學(xué)動物部)；Con A及EGCG (Sigma公司)；ELISA試劑盒 (上海信然生物公司)；CXCR3單克隆抗體(Zymed公司)。

1.2動物模型的建立及分組C57BL/6小鼠分4組：正常對照組、EGCG對照組、ConA模型組及EGCG+ConA模型組。EGCG對照組和EGCG+ConA組每天經(jīng)灌胃給予5 mg/kg的EGCG，2次/d，共10 d，正常對照組和模型組同時給予等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)。10 d后，模型組和EGCG+ConA組小鼠經(jīng)尾靜脈注射給予15 mg/kg的ConA，正常對照組和EGCG對照組同時給予等體積的PBS，注射10 h后取各組小鼠外周血并處死取肝組織。

1.3小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測小鼠麻醉后，摘眼球取血，離心后取上層血清，全自動生化儀法檢測小鼠血清ALT、AST的水平。

1.4酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測小鼠肝組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ及CXCR3的水平處死小鼠后留取肝組織ELISA法檢測TNF-α、IFN-r及CXCR3的水平。具體參照ELISA說明書進(jìn)行。

1.5HE染色小鼠麻醉后，無菌取肝臟組織，10%中性甲醛液浸泡，制作成蠟塊，包埋、切片、脫蠟至水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水反藍(lán)、伊紅染色、后進(jìn)行脫水、透明、封片，最后顯微鏡下觀察染色效果，并于200倍下拍照。

1.6免疫組化法檢測CXCR3在小鼠肝組織的表達(dá)切片常規(guī)脫蠟至水,高溫高壓組織抗原修復(fù),CXCR3抗體按1∶200稀釋,常規(guī)脫蠟、水化、微波恢復(fù)抗原,DAB顯色,常規(guī)復(fù)染封片，用彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像，在高倍鏡(×200)下檢測,以細(xì)胞質(zhì)、核膜或胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1EGCG對各組小鼠ALT、AST的影響ConA模型組小鼠ALT、AST、TNF-α、IFN-γ、CXCR3的水平均較正常對照組顯著升高(P<0.05)，提示出現(xiàn)了明顯的肝損傷。與ConA模型組小鼠比較，EGCG+ConA組ALT、AST的水平降低，肝損傷減輕(P<0.05)。見表1。

2.2各組小鼠肝組織中TNF-α、IFN-γ及CXCR3的表達(dá)ConA模型組小鼠肝臟TNF-α、IFN-γ、CXCR3的水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)，與ConA模型組比較，與肝損傷一致；經(jīng)EGCG治療后小鼠上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3肝臟結(jié)構(gòu)光鏡下的改變正常對照組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)正常。EGCG對照組小鼠可見肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)正常。ConA模型組小鼠(注射ConA 10 h)后可見肝細(xì)胞水腫，充血壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見灶性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。EGCG對照組小鼠肝細(xì)胞水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)可見，偶有不完整，匯管區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.4免疫組化結(jié)果ConA模型組小鼠肝臟組織細(xì)胞內(nèi)CXCR3的表達(dá)明顯多于正常對照組和EGCG對照組。 EGCG治療后CXCR3的表達(dá)較模型組減少。見圖2。

表1　各組小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IFN-α及CXCR3的水平變化

與正常對照組比較：1)P<0.05，與ConA模型組比較：2)P<0.05

圖1　各組小鼠肝組織病理切片的變化(HE，×200)

圖2　CXCR3 在各組小鼠肝組織的表達(dá)(DAB，×200)

3討論

ConA可與循環(huán)中的巨噬細(xì)胞成分組合，活化肝內(nèi)的T淋巴細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)，對肝細(xì)胞造成損傷，對肝臟有器官特異性，常用來建造免疫性肝損傷模型。

目前對于免疫性肝損傷的治療主要有糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，而這些藥物由于嚴(yán)重的不良反應(yīng)使應(yīng)用受到限制。因此積極尋找一種新的治療方法和藥物具有重要的臨床意義。EGCG是茶多酚中含量較高的物質(zhì)，也是兒茶素類化合物中生物學(xué)效應(yīng)最強的一種，有報道EGCG通過抑制炎性因子的表達(dá)減輕了ConA誘導(dǎo)的肝損傷，而炎性因子TNF-α、IFN-γ在ConA誘導(dǎo)的肝損傷過程中具有舉足輕重的作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過EGCC治療的模型組小鼠無論是血清轉(zhuǎn)氨酶還是肝臟形態(tài)學(xué)改變均明顯減輕，同時TNF-α、IFN-γ的表達(dá)亦明顯減輕，與文獻(xiàn)報道一致。

趨化因子是一類可以激發(fā)白細(xì)胞趨化性的小分子分泌性蛋白質(zhì)，能夠吸引中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞移動到炎癥灶，并增強炎性細(xì)胞的吞噬殺傷功能，直接參與炎癥過程，并且在肝臟免疫反應(yīng)尤其是淋巴細(xì)胞歸巢的細(xì)胞間黏附過程中有重要的地位〔3〕。因此對ConA誘導(dǎo)的免疫性肝損傷趨化因子的測定可以間接判斷肝臟的損傷程度。IP-10 是新近發(fā)現(xiàn)的屬于CXC類的趨化因子，CXCR3 是目前發(fā)現(xiàn)的IP-10 的唯一受體，所以CXCR3是目前人們研究較多的一類趨化因子。近年研究發(fā)現(xiàn): 在自身免疫性肝病、慢性丙型肝炎、乙型肝炎病毒感染動物模型中IP- 10、CXCR3 的分泌增加〔4~6〕，而CXCR3僅表達(dá)于TH1細(xì)胞〔7〕，并且與許多自身免疫性疾病相關(guān)。有實驗發(fā)現(xiàn)，PBC患者肝臟的門脈區(qū)有超過半數(shù)的CD4+T細(xì)胞表達(dá)CXCR3〔8〕。Chen等〔9〕在銀屑病皮損中，發(fā)現(xiàn)CXCR3 mRNA表達(dá)增多，其配體CXCL9-11的mRNA水平也明顯升高。Henneken等〔10〕在RA患者外周血B細(xì)胞中檢測到CXCR3水平升高，關(guān)節(jié)滑液中CXCL9、CXCL10水平亦明顯升高。還有人〔11〕在狼瘡性腎炎的腎組織細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的CXCR3。

本實驗提示CXCR3參與肝損害的發(fā)生；而經(jīng)EGCC治療的小鼠CXCR3的表達(dá)顯著下降，與轉(zhuǎn)氨酶及TNF-α、IFN-γ的變化及肝臟形態(tài)學(xué)變化趨勢一致，顯示了EGCC在減輕肝損傷的同時降低了肝臟中CXCR3的表達(dá)，進(jìn)一步提示EGCC保護(hù)肝臟的作用可能與調(diào)節(jié)CXCR3的表達(dá)有關(guān)。

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〔2014-05-12修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)