鞘內注射右美托咪定對骨癌痛大鼠脊髓小膠質細胞活化及Toll樣受體的影響

鞘內注射右美托咪定對骨癌痛大鼠脊髓小膠質細胞活化及Toll樣受體的影響

孟根其其格羅建軍張毅1

(北京市東城區第一人民醫院麻醉科，北京100075)

摘要〔〕目的探討鞘內注射右美托咪定(DEX)對骨癌痛大鼠脊髓小膠質細胞活化的影響。方法通過向健康雄性SD大鼠(200～250 g)脛骨骨髓腔內注射Walker256乳腺癌細胞液制備骨癌痛(BCP)模型后進行鞘內置管，將45只成功誘導BCP大鼠模型隨機分組(n=15)：高劑量DEX(DEX-H)組、低劑量DEX(DEX-L)組及生理鹽水(NS)組，DEX-H與DEX-L組分別于鞘內注入6 μg·kg-1·d-1或3 μg·kg-1·d-1(注射體積均為10 μl)，同時選取15只同周齡大鼠作對照(C)，其余兩組鞘內注入等體積生理鹽水。于鞘內注射前后對4組進行行為學檢測來分析DEX對BCP大鼠機械縮足閾值(MWT)和縮足熱潛伏期(WTL)的影響，采用熒光免疫組化法檢測各組鞘內注射7 d后的脊髓小膠質細胞特異表達補體C3受體(OX-42)的熒光積分光密度(IOD)，酶聯免疫吸附法檢測脊髓腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1β水平，免疫印跡檢測脊髓Toll樣受體(TLR)4及TLR2蛋白水平。結果與C組相比，NS組鞘內注射0~7d的NMT和WTL降低，脊髓小膠質細胞OX-42的IOD、脊髓TNF-α和IL-1β水平及Toll樣受體表達均升高(P<0.05)；給予DEX鞘內注射可改善BCP大鼠的以上異常指標(P<0.05)，但與C組均有統計學差異(P<0.05)；且DEX-H組的以上指標均優于DEX-L組(P<0.05)。結論鞘內注射DEX對BCP大鼠有較好的鎮痛作用并抑制了脊髓小膠質細胞活化，可能與其緩解炎癥反應及降低Toll樣受體表達有關。

關鍵詞〔〕右美托咪定；骨癌痛；鎮痛；脊髓小膠質細胞活化

中圖分類號〔〕R73〔文獻標識碼〕A〔

1新疆醫科大學附屬中醫醫院手術麻醉科

第一作者：孟根其其格(1979-)，女，主治醫師，主要從事老年麻醉、骨科麻醉研究。

骨轉移癌會引起中重度骨痛，嚴重影響生活質量，同時也會導致患者體能狀態下降及焦慮或抑郁發生〔1〕。目前，疼痛治療的重點已轉移至神經膠質細胞，且已證實神經膠質細胞參與病理性疼痛的發生發展〔2〕。疼痛時，處于靜息狀態的小膠質細胞被活化，因此抑制神經小膠質細胞活化成為疼痛治療的有效措施〔3〕。右美托咪啶(DEX)為一種α2腎上腺素能受體激動劑，具有高選擇性、高效的優點，可起到鎮靜催眠、鎮痛及抑制交感神經活動的作用，且不良反應低，在臨床應用較廣〔4，5〕。筆者推測DEX對骨癌痛亦有較好的鎮痛作用。鑒于鞘內注射是臨床治療疼痛的常用手段，故本研究給予骨癌痛大鼠模型鞘內注射DEX，觀察對小膠質細胞活化的影響。

1材料與方法

1.1試劑與主要儀器DEX由于江蘇新晨制藥有限公司提供；Walker256乳腺癌細胞購自上海生物醫學工程研究院；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自碧云天生物科技公司；Triton X-100、苯甲基黃酰氟及Tris-HCl及購自美國Sigma公司；白介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)α檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；羊抗特異表達補體C3受體(OX-42)抗體購自美國Abcam公司，兔抗Toll樣受體(TLR)4及TLR2抗體均購自美國Santa Cruz公司；紅色標記的二抗購自上海亨代勞生物有限公司。儀器：Multiskan Ascent酶標儀購自Thermo公司；5424R小型臺式冷凍離心機、移液槍均購自德國Eppendorf公司；全自動熱輻射刺激儀購自中國科學院生物醫學工程研究所；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2動物與分組通過向健康雄性SD大鼠(200～250 g)脛骨骨髓腔內注射Walker256乳腺癌細胞液制備骨癌痛(BCP)模型后進行鞘內置管，將45只成功誘導BCP大鼠模型隨機分組(n=15)：高劑量DEX(DEX-H)組、低劑量DEX(DEX-L)組及生理鹽水(NS)組，DEX-H與DEX-L組分別于鞘內注入6、3 μg·kg-1·d-1(注射體積均為10 μl)，同時選取15只同周齡大鼠作對照(C)，其余兩組鞘內注入等體積生理鹽水。

1.3BCP模型制備及鞘內置管根據文獻〔6〕制備BCP模型：給予BCP大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，待大鼠充分麻醉后，取仰臥位后對左后肢進行消毒備皮，采用手術刀切開皮膚，分離肌肉筋膜充分暴露脛骨，于脛骨結節下外0.5~1 cm的脛骨平臺位置，采用微量注射器抽取Walker256乳腺癌細胞液，向骨髓腔注射10 μl細胞液，用骨蠟封住針孔并縫合。待BCP制備后5 d根據Sluka等〔7〕的方法進行鞘內置管：切開枕部皮膚后，22G無菌注射器枕頭刺破寰枕膜，待腦脊液流出后置入PE-10導管，固定好導管后縫合皮膚。術后肌注青霉素預防感染。

1.4行為學評價分別于鞘內注射前、鞘內注射不同時間點(1、3、5、7 d)后進行行為學檢測，分析DEX鞘內注射對機械縮足閾值(MWT)和縮足熱潛伏期(WTL)的影響，來評價其鎮痛效果。MWT：采用不同折力(1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g)Von Frey纖維刺激足底中部，每次刺激6~8 s，每次刺激間隔1 min，當大鼠出現快速縮足或舔足，則定義為陽性反應，重復5次，3次以上陽性反應的最小刺激力度計為MWT。WTL：采用全自動熱輻射刺激儀照射足底，每次照射不超過25s，每次重復3次，間隔5 min，3次出現抬腿反應的時間平均值計為WTL。MWT和WTL的數值越小，就表明痛覺越敏感。

1.5熒光免疫組化采用脊髓小膠質細胞特異性標記物OX-42的熒光積分光密度(IOD)值來評價其活化情況。過量麻醉致死后，迅速取出大鼠的L4~6脊髓段，經多聚甲醛固定、蔗糖脫水后，制備厚20 μm的冠狀冰凍切片，每隔5張保留1張片子，每隔脊髓樣本選取5張用于免疫組化，經H2O2室溫孵育及山羊血清封閉后，滴加OX-42的一抗(1∶100)，4℃孵育過夜后，滴加紅色標記的二抗，將片子置于熒光顯微鏡下觀察，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定熒光積分光密度(IOD)。

1.6酶聯免疫吸附法將新鮮脊髓標本取出后，于冰上進行裂解，以5 000 r/min離心5 min后保留上清，采用對應試劑盒檢測脊髓提取液中的TNF-α、IL-1β含量，以上操作均嚴格遵守試劑盒說明書。

1.7免疫印跡BCA法檢測脊髓提取液中的蛋白濃度，每個樣本取等量蛋白，與上樣緩沖液混勻、煮沸，上樣后行10% SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉法將電泳條帶轉移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉后，根據膜面積加入TLR-2(1∶100)、TLR-4(1∶200)一抗，4℃孵育過夜，次日加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，以GAPDH為內參(1∶3 000)，ECL化學發光法顯影，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析各條帶光密度，結果表示為目的條帶與內參的光密度比值。

1.8統計學分析采用SPSS16.0軟件，組間比較采用t檢驗及單因素分析。

2結果

2.1鞘內注射DEX對MWT的影響與C組比較，NS組鞘內注射0~7 d的NMT水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；給予DEX鞘內注射可升高BCP大鼠模型的MWT(P<0.05)，但與C組的差異仍有統計學意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內注射1~7 d的NMT水平均高于DEX-L組(P<0.05)。見圖1A。

2.2鞘內注射DEX對WTL的影響與C組比較，NS組鞘內注射0~7 d的WTL水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；給予DEX鞘內注射可升高BCP大鼠模型的WTL(P<0.05)，但與C組的差異仍有統計學意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內注射1~7 d的WTL水平均高于DEX-L組(P<0.05)。見圖1B。

2.3鞘內注射DEX對脊髓小膠質細胞活化的影響NS組鞘內注射7d的小膠質細胞OX-42的IOD為662.8±53.7，高于C組的246.7±21.5，差異有統計學意義(P<0.05)；給予DEX鞘內注射可降低BCP大鼠模型的小膠質細胞OX-42的IOD水平，但與C組的差異仍有統計學意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內注射7d的IOD水平為345.9±25.8，低于DEX-L組的492.3±44.2，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 鞘內注射DEX對脊髓細胞炎癥因子水平的影響與C組比較，NS組鞘內注射7 d后的脊髓TNF-α和IL-1β水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；給予DEX鞘內注射可降低BCP大鼠模型的脊髓TNF-α和IL-1β水平(P<0.05)，但與C組的差異仍有統計學意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內注射7 d后的脊髓TNF-α和IL-1β水平均低于DEX-L組(P<0.05)。見表1。

A：MWT；B：WTL；與C組比較：1)P<0.05；與NS組比較：2)P<0.05；與DEX-L組比較：3)P<0.05 圖1　鞘內注射DEX對MWT和WTL的影響

圖2　鞘內注射DEX對脊髓小膠質細胞OX-42的IOD影響(×400)

2.5鞘內注射DEX對脊髓Toll樣受體表達的影響與C組比較，NS組鞘內注射7d后的脊髓TLR-2和TLR-4蛋白水平升高(P<0.05)；給予DEX鞘內注射可降低BCP大鼠模型的脊髓TLR-2和TLR-4水平(P<0.05)，但與C組的差異仍有統計學意義(P<0.05)；DEX-H組鞘內注射7 d后的脊髓TLR-2和TLR-4水平均低于DEX-L組(P<0.05)。見圖3，表2。

表1　鞘內注射DEX對脊髓細胞炎癥因子水平的

與C組比較：1)P<0.05；與NS組比較：2)P<0.05；與DEX-L組比較：3)P<0.05；下表同

圖3　鞘內注射DEX對脊髓Toll樣受體表達的影響

組別TLR2TLR4C組0.18±0.050.22±0.03NS組0.57±0.031)0.74±0.051)DEX-L組0.39±0.061)2)0.45±0.041)2)DEX-H組0.25±0.021)2)3)0.36±0.041)2)3)

3討論

骨癌痛是一種中重度病理性疼痛，嚴重影響患者生活質量。為研究鞘內注射DEX對骨癌痛有無改善作用，本研究采用公認的動物模型，即通過采用Walker256乳腺癌細胞向脛骨上段骨髓腔內注射來制備BCP模型。大鼠在骨髓腔內接種乳腺癌細胞后會引起骨破壞，主要表現為骨皮質和骨小梁損傷，尤其在接種12 d后會脛骨骨髓腔會出現大規模腫瘤細胞浸潤〔8〕。本研究根據相關文獻報告于BCP模型制備10 d后進行鞘內注射治療，同時為研究DEX對癌痛的治療效果，本研究采用兩個劑量研究鞘內注射DEX對骨癌痛大鼠脊髓小膠質細胞活化的影響。

本研究發現：BCP模型建立后，大鼠的疼痛閾值降低，主要表現為MWT和WTL水平均升高，提示BCP模型建議成功，且在為期7 d的治療中，NS組的MWT和WTL水平均維持在一個穩定水平，提示該種模型的疼痛狀態較為穩定，不會通過機體的代償而緩解或恢復，可更好地研究DEX的鎮痛效果。給予DEX鞘內注射后發現，治療1 d后MWT和WTL水平即升高，差異有統計學意義，以上表明DEX對BCP疼痛有改善效果，且改善效果可持續7 d。

目前，小膠質細胞已成為疼痛干預的重點，約占神經膠質細胞的5%~10%，在正常情況下為靜息狀態，但外界刺激可引起小膠質細胞激活，如參與術后持續性疼痛形成及神經病理性疼痛有關〔9，10〕。小膠質細胞，由脊髓單核細胞分化而來，當其活化時，其主要表面抗原物質OX-42會大量表達〔11〕，故本研究采用熒光免疫組化法檢測OX-42的IOD評價小膠質細胞的激活情況。本研究發現：NS組的IOD值高于C組，提示BCP大鼠的小膠質細胞處于活化狀態，與癌細胞浸潤引起的疼痛有關，而DEX鞘內注射后IOD降低，提示DEX可抑制小膠質細胞活化，為其鎮痛的主要原因。疼痛可引起炎癥反應，尤其當小膠質細胞處于活化狀態時〔12〕，本研究中BCP大鼠的脊髓常見炎癥因子TNF-α和IL-1β水平升高，而給予DEX鞘內注射后，以上炎癥因子水平降低，表明DEX可緩解炎癥反應。Toll樣受體介導了炎癥反應〔13〕，而本研究發現BCP大鼠的TLR-2和TLR-4水平均升高，更加證實了癌痛大鼠出現了炎癥反應，而給予DEX后兩者水平下調，與其改善炎癥反應的結論一致。

參考文獻4

1Cheng M，Liu L，Yang HS，etal.Circulating tumor cells are associated with bone metastasis of lung cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2014；15(15)：6369-74.

2Vallejo R，Tilley DM，Vogel L，etal.The role of glia and the immune system in the development and maintenance of neuropathic pain〔J〕.Pain Pract，2010；10(3)：167-84.

3Jun IG，Kim SH，Yoon YI，etal.Intrathecal lamotrigine attenuates antinociceptive morphine tolerance and suppresses spinal glial cell activation in morphine-tolerant rats〔J〕.J Korean Med Sci，2013；28(2)：300-7.

4劉征宇，溫蔚，雷恩駿，等.小劑量右美托咪啶應用于高齡患者全身麻醉的效果〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(24)：4935-6.

5李春萍，杜奕鵬，宋雪松，等.右美托咪定對老年患者術后舒芬太尼自控靜脈鎮痛效果的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(16)：3043-4.

6李曉青，孫玉明，黃章翔，等.Walker 256乳腺癌細胞構建大鼠脛骨骨癌痛模型〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2008；15(1)：41-5.

7Sluka KA，Audette KM.Activation of protein kinase C in the spinal cord produces mechanical hyperalgesia by activating glutamate receptors，but does not mediate chronic muscle-induced hyperalgesia〔J〕.Mol Pain，2006；2：13.

8陳勇，杜曉紅，應俊，等.鞘內注射Staurosporine對骨癌痛大鼠脊髓小膠質細胞活化的影響〔J〕.臨床麻醉學雜志，2013；29(12)：1214-7.

9Zhuo M，Wu G，Wu LJ.Neuronal and microglial mechanisms of neuropathic pain〔J〕.Mol Brain，2011；30(4)：31.

10應彥璐，許學兵，佘守章，等.背根神經節小膠質細胞活化在大鼠術后持續性痛形成中的作用〔J〕.中華麻醉學雜志，2013；33(2)：156-8.

11盧波，肖純，孫建良，等.神經病理性疼痛中脊髓小膠質細胞活化的分子機制〔J〕.國際麻醉學與復蘇雜志，2013；34(6)：548-51.

12王新，李明軍，張坤，等.腦出血與小膠質細胞介導的炎癥相關性〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(13)：3268-70.

13方靜，杜麗，付輝，等.炎癥反應中的microRNAs及其在TLR信號通路中的調控作用〔J〕.第二軍醫大學學報，2013；34(7)：782-6.

〔2014-07-20修回〕

(編輯滕欣航)