水通道蛋白-4在抑郁及抗抑郁大鼠模型海馬區的表達

水通道蛋白-4在抑郁及抗抑郁大鼠模型海馬區的表達

任愛華王海鵬趙華1何欣

(北華大學醫學院，吉林吉林132000)

摘要〔〕目的探討抑郁及抗抑郁模型大鼠海馬區水通道蛋白(AQP)-4的表達。方法通過采用慢性不可預見性刺激和孤養相結合的方法，在應激第21天后對大鼠稱量體重、測24 h糖攝取量，灌流取腦，免疫組化觀察海馬區AQP-4的變化。結果抑郁大鼠體重和糖攝取量明顯少于正常對照組及抗抑郁組，抑郁模型大鼠海馬區神經元出現凋亡及AQP-4表達增加。結論AQP-4在抑郁模型大鼠腦中對抑郁癥的發病發揮重要作用。

關鍵詞〔〕抑郁癥；海馬；慢性應激；水通道蛋白-4

中圖分類號〔〕R74〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：何欣(1957-)，男，教授，碩士生導師，主要從事神經解剖學研究。

1吉林大學基礎醫學院

第一作者：任愛華(1976-)，男，碩士，講師，主要從事神經解剖學研究。

抑郁癥(DEP)是在持續困境的作用下，可引發精神障礙，日益受到全社會的普遍關注并成為研究的熱點〔1〕。本實驗采用不可預知的長期溫和應激刺激(CUMS)和分養2種經典模型相結合的方式制造抑郁模型〔2〕。以往研究〔3~5〕表明抑郁模型大鼠海馬區錐體細胞和顆粒細胞再生減少和萎縮。但目前國內外對于抑郁患者發病機制不能完全統一，本實驗在形態學上揭示CUMS模型大鼠海馬區水通道蛋白(AQP)-4表達的改變，來分析神經元凋亡的原因及機制。

1材料和方法

1.1動物、儀器及試劑采用吉林大學試驗動物研制中心提供的清潔級Wistar雄性大鼠27只，體重180~190 g，清潔級動物飼料喂養，飼養環境清潔且有晝夜光線變化適應1 w。電刺激器(蚌埠第二儀器廠)；Tiger 2000圖像分析儀(重慶大學軟件研究所)；Nikon 數碼照相機(日本)。S-P試劑盒(福州邁新公司提供)；兔抗AQP-4抗體，由吉林大學病理生理教研室贈送。氟西汀常州第四制藥廠。

1.2方法

1.2.1動物模型建立、觀察及分組隨機分為正常對照組、抑郁模型組和給藥組大鼠各9只。制備抑郁動物模型的方法：每天隨機實施一種不同的應激刺激，包括足底電擊、熱、禁食禁水、疼痛、饑渴、冰水游泳等，持續21 d。正常對照組不接受刺激。給藥組給予氟西汀治療，量為10 mg/kg,1次/d,皮下注射,共4 w。在第22天對各組進行稱量體重及記錄第22天24 h內大鼠蔗糖攝取量〔6〕，在應激前后都用open- field法進行行為評分〔7〕。

1.2.2腦組織取材、固定、切片及表片在第22天兩組大鼠分別用10%水合氯醛行腹腔內注射麻醉后，在心尖部注射50 U/100 g的肝素抗凝，用200 ml生理鹽水快速灌注，然后用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注，開顱取腦組織于后固定液(4%多聚甲醛溶液)24 h，行石蠟包埋。連續冠狀切片，片厚6 μm，隔5取1片，表片，貼片分成3套，56℃恒溫箱干燥。一套用來觀察核團部位，一套行AQP-4免疫組化染色，一套備用。

1.2.3SP法免疫組織化學染色常規脫蠟、脫水，抗原修復，玻片上滴加過氧化氫溶液(SP試劑盒中試劑A)，室溫下于濕盒中孵育20 min，以阻斷內源性過氧化物酶的作用。0.01 mol/L PBS沖洗，5 min，3次。滴加非免疫動物血清(SP試劑盒中試劑B)，室溫下于濕盒中孵育20 min以減少非特異性免疫結合反應。0.01 mol/L PBS沖洗，5 min，3次。滴加兔抗大鼠AQP-4工作濃度為1∶50，4℃過夜，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min，3次。滴加生物素標記羊抗兔(SP試劑盒中試劑C)，室溫下于濕盒中孵育20 min，0.01 mol/L沖洗，5 min，3次。滴加鏈霉素生物素蛋白-過氧化物酶溶液(SP試劑盒中試劑D)，室溫下于濕盒中孵育20 min，0.01 mol/L PBS沖洗，5 min×3次。滴加新配制的二甲基聯苯胺(DAB)顯色劑。蘇木素復染。80%、90%乙醇、無水乙醇各3 min脫水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min透明。中性樹膠封片。陰性對照采用替代實驗，即用PBS代替一抗來孵育切片，其他步驟相同。

1.2.4AQP-4陽性細胞的計數方法陽性神經元的形態學觀察及測定，于OLYMPUS顯微鏡下，放大400倍，確定海馬內AQP-4陽性神經細胞的形態及分布。免疫組化染色:染色強度以多數細胞為準，染色陰性為(-)，染色呈淡棕黃色為(+)，深棕黃色為()，深棕褐色為()。圖像分析儀處理:先在每張免疫組化染色切片上，取空白區，測定背景的灰度值。隨機取20個陽性細胞，用鼠標描繪所測細胞的胞膜區域，計算機自動測量灰度。減去背景值再除以20，獲得該切片陽性細胞的平均灰度值。

2結果

2.1應激對大鼠行為的影響隨應激時間的增加，應激大鼠逐漸出現行動遲緩、活動減少，食欲不振、對環境變化失去興趣。在第22天時，觀察大鼠的水平運動、垂直運動及理毛時間及排便次數與正常對照組相比都明顯減少(P<0.01)。見表1。

表1　應激及藥物治療對大鼠open-field行為的影響

與正常對照組第22天比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組第22天比較：3)P<0.01，4)P<0.05

2.2應激對大鼠蔗糖攝取量及體重的影響 在應激第22天后，模型組蔗糖攝取量〔(0.25±3.99)ml〕及平均體重〔(204.17±9.75)g〕與正常對照組〔(19±3.7)ml,(263.33±16.43)g〕及給藥組〔(17.14±4.15)ml,(251.66±15.22)g〕大鼠比較明顯降低(P<0.05)。

2.3應激對大鼠海馬AQP-4免疫組化染色的影響正常對照組大鼠可見海馬和齒狀回各層中，最明顯的是胞體較大的呈三角形的錐體細胞層和胞體呈圓形或卵圓形的顆粒細胞層，其排列緊密、規則，細胞核清晰可見，胞膜連續完整，神經元排列層次整齊未見神經元細胞核固縮和空泡現象。模型組大鼠海馬各區神經元顆粒細胞層較正常對照組和給藥組明顯減少，且錐體細胞層和顆粒細胞層的神經元排列疏松、散亂，尤其在抑郁組海馬的CA1、CA3、齒狀回神經元細胞減少，較多的神經細胞出現空泡和核固縮，部分細胞的脫落形成了空泡。在海馬各區神經元中，以齒狀回神經元減少最多，其次為CA1區。AQP-4在大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回各區都可以見到，主要局限在星形膠質細胞結構特點的膠質細胞和室管膜細胞亞群，在血管的周圍膠質細胞的足突呈現強烈的標記，呈深棕色，海馬的錐體細胞層、齒狀回顆粒細胞層和多形細胞層上有的表達，呈棕黃色。抑郁模型組較正常對照組和給藥組海馬區齒狀回表達較多，在CA1、CA3區也明顯增多，見圖1。與正常對照組平均灰度值19.18±2.31相比，模型組大鼠海馬AQP-4平均灰度值顯著升高〔(31.12±3.27)，P<0.05〕，給藥組為23.22±3.13。

正常對照組

模型組

給藥組

3討論

對于評價一個DEP模型的制作是否成功主要依據動物在行為上的變化〔8〕，本模型中動物經22 d慢性綜合性應激后，大鼠活動明顯減少；測量在應激結束后大鼠體重及24 h糖攝入量均少與對照組和給藥組；發現抑郁模型大鼠海馬各區神經元顆粒細胞層減少，且錐體細胞層和顆粒細胞層的神經元排列疏松、散亂。在行為學和形態學上都與國際上診斷抑郁模型標準相一致，表明本實驗中大鼠DEP模型的制作是成功的。

AQP4是中樞神經系統表達量最多的一類水通道蛋白，主要富集表達于星形膠質細胞上，調節腦脊液體積，同時參與調節星形膠質細胞的功能〔9〕。目前的觀點認為，神經干細胞屬于星形膠質細胞家系中成員之一，其表面同樣高度表達AQP4〔10〕。AQP4敲除小鼠紋狀體，皮層，海馬內谷氨酸、單胺類神經遞質及其代謝產物的含量明顯改變〔11〕。由此可見AQP4調節腦內物質代謝平衡。抗抑郁藥治療能提高腦內血管內皮生長因子(VEGF)的水平，VEGF能促進神經再生，而且阻斷VEGF信號通路也能抑制抗抑郁藥的促增殖作用〔12〕。 氟西汀是治療抑郁癥的經典藥物之一，氟西汀可以逆轉應激動物模型海馬區的星形膠質細胞數目減少〔13〕，而且對離體培養的神經干細胞有直接的促增殖作用〔14〕。能夠促進體外培養的原代星形膠質細胞合成和分泌腦源性神經生長因子(BDNF)，膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)等神經營養因子〔15〕。由以上可以看出AQP-4的這些生理作用對于腦組織維持一個適宜的內環境穩定是非常重要的。在本實驗中，AQP-4增加可能由于長期刺激使腦內環境改變，同時參與改善腦內環境。在抑郁模型的大鼠的海馬里出現神經元的凋亡，凋亡的細胞釋放過多的K+和血糖(GLU)，這些過多的K+和GLU進一步促使AQP-4為維持內環境的平衡穩定而適應性增加，把過多的K+和GLU轉運到神經膠質細胞內，從而導致膠質細胞的死亡和數目減少，神經膠質細胞給神經原細胞提供營養，所以進一步加重了海馬區神經元的凋亡。而氟西汀能夠有效地逆轉這種凋亡，是較為肯定的治療藥物。

綜上所述，從本實驗中我們可以看出來AQP-4既參加調節抑郁模型大鼠海馬區內環境，同時對抑郁模型大鼠海馬區神經原的凋亡發揮作用。氟西汀治療抑郁的機制之一是提升大鼠海馬區5-HT濃度，進而影響AQP-4的表達，達到抗抑郁的作用，所以AQP-4既有正面積極的作用，也有負面影響，這為以后在抑郁癥發病機制的研究中提供了新的方向。

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〔2013-11-18修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

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