靈芝酸對鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用

靈芝酸對鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用

王麗欣劉蕾劉君星馬小茹王芳芳梁衍鋒吳佳梅王淑秋齊亞靈

(佳木斯大學基礎醫學院病理生理學教研室，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的觀察靈芝酸對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元p-Akt、Akt蛋白表達的影響，并通過應用wortmannin阻斷PI3K/Akt通路，探討靈芝酸是否具有抗癲癇作用及其作用機制。方法選取雄性SD大鼠50只，隨機分為5組(n=10)，A組：生理鹽水對照組，B組：癲癇模型組，C組：靈芝酸干預組，D組：wortmannin抑制劑組，E組：二甲基亞砜(DMSO)對照組。每組給予相應藥后，對大鼠進行行為學觀察、HE染色法檢測海馬神經元細胞形態學變化，免疫組化法檢測各組大鼠海馬區p-Akt、Akt蛋白表達。結果與A組相比，B、C、D、E組p-Akt、Akt的表達量相對較高(P<0.01)；靈芝酸干預后，C、D、E組p-Akt、Akt的表達量明顯比B組增高(P<0.05)；PI3K/Akt通路被阻斷后，C、E兩組p-Akt、Akt的表達量明顯比D組增高(P<0.05)。結論靈芝酸對海馬神經元具有一定的保護作用，并且其機制與PI3K/Akt通路的活化并影響其下游蛋白的表達有關。

關鍵詞〔〕靈芝酸；癲癇；PI3K/AKT；p-Akt；Akt

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：佳木斯大學研究生科技創新項目(LZZ2014_004)

通訊作者：王淑秋(1957-)，女，教授，碩士生導師，主要從事神經免疫內分泌的病理生理學研究。

齊亞靈(1967-)，女，醫學博士，教授，博士生導師，主要從事中藥抗衰老研究。

第一作者：王麗欣(1988-)，女，在讀碩士，主要從事癲癇發病機制及中藥治療研究。

癲癇主要是由于大腦一過性放電引起的發作性意識喪失〔1，2〕，其病理改變是海馬神經元的損傷。靈芝酸作為靈芝的精華，在20世紀80年代就被分離并純化 ，并證實其中含有的有效成分可對臨床上多種常見疾病有防治功效，但是關于靈芝酸對癲癇的防治方面罕有報道。本實驗主要通過給予癲癇模型大鼠腹腔注射靈芝酸，并通過PI3K/Akt通路阻斷劑wortmannin干預致癇大鼠，觀察大鼠海馬區Akt、磷酸化Akt(P-Alct)的表達變化，探討靈芝酸對癲癇大鼠的海馬神經元是否具有保護作用。

1材料與方法

1.1實驗材料SD大鼠(大連醫科大學實驗動物中心提供)；靈芝酸(大連美侖生物技術有限公司)；p-Akt、Akt抗體(美國santa cruz生物技術公司)；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(武漢博士德公司)；BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟生物科技公司)。

1.2分組與給藥健康雄性SD大鼠50只，體重(180±20)g，隨機分為5組(n=10)，A組：對照組，腹腔注射與氯化鋰等量的生理鹽水，20 h后經腹腔注射與靈芝酸等量的生理鹽水，30 min 后注射與硫酸阿托品等量的生理鹽水，30 min后注射與匹魯卡品等量的生理鹽水。B組：癲癇模型組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預處理，20 h后腹腔注射與靈芝酸等量的生理鹽水，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應。C：靈芝酸干預組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預處理，20 h后腹腔注射靈芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應。D組：wortmannin抑制劑組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預處理，20 h后腹腔注射靈芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應。靈芝酸注射前60 min腹腔注射wortmannin(1 mg/kg)。E組：二甲基亞砜(DMSO)對照組，大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)預處理，20 h后腹腔注射靈芝酸(10 mg/kg)，60 min后腹腔注射匹魯卡品(80 mg/kg)，在匹魯卡品腹腔注射前30 min給予皮下注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，以拮抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應。靈芝酸注射前60 min腹腔注射DMSO(0.5 mg/kg)。匹魯卡品注射后大鼠出現Ⅳ、Ⅴ級發作，并且持續30 min以上全身性驚厥者視為造模成功。癲癇發作1 h后根據分組情況腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)終止發作，注射止痙劑30 min仍沒有終止發作，可原劑量重復注射1次。終止發作后6 h取材。

1.3取材與標本制備癲癇終止后6 h給予水合氯醛過量麻醉大鼠，眼科剪刀開胸后分離心包，找到左心室，動脈導管尖端于心尖部行主動脈插管，剪開右心耳，以便血液及灌注液流出。先注入0.9%生理鹽水約50 ml，待心耳開口流出透明液體時換為4%多聚甲醛50 ml灌流固定大鼠，大鼠出現抽搐時方可開顱取腦，并置于甲醛溶液中放入4℃冰箱二次固定。24 h后去海馬部行石蠟包埋，切片機冠狀連續切片，切至所需海馬組織，每片厚度為5 μm，放入恒溫干燥箱中8 h后分別進行HE及免疫組化染色。

1.4海馬組織病理學觀察①HE染色。切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，常規蘇木素、伊紅染色，透明，封片，光鏡下觀察海馬區細胞結構。②免疫組織化學染色將切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原熱修復，滴加5%BSA封閉液37℃孵育20 min，加入p-Akt、Akt一抗4℃過夜，次日加入二抗、SABC、DAB顯色劑，最后用蘇木素輕度復染，用PBS代替一抗作為陰性對照。鏡下觀察海馬神經細胞中p-Akt及Akt蛋白的表達。每一標本隨機取3張切片，每張切片隨機取5個不重復的視野，分別對染色的陽性細胞計數，然后取3張切片陽性細胞數的均值作為該標本結果，以每組5例樣本觀察結果的平均值作為每組的實驗結果。

1.5統計學方法應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1大鼠行為學觀察除A組外，各組大鼠基本達到Ⅳ級以上癲癇發作水平。表現為后肢站立、前肢陣攣；四肢抽搐并跌倒、旋轉，并且持續發作30 min以上，其中死亡13只，未達發作標準5只，均予以隨機替換補充。

2.2HE染色結果光鏡下可見A組大鼠海馬CA1區及CA3區神經元呈多層分布，椎體細胞及顆粒細胞排列緊密，形態正常，胞體呈圓形或橢圓形，細胞樹突稠密，側支豐富。B組神經元數目明顯減少，排列紊亂，胞體變小甚至破裂，核固縮，神經元發生變形。B組較C、D、E組海馬神經元變性、壞死的數量和程度要重，并且D組損傷的程度較C組和E組重。見圖1。

2.3免疫組化結果兩種蛋白均在胞質中表達，胞膜和胞核僅有少量表達。A組胞質中偶有棕黃色顆粒分布。見圖2。其余四組中p-Akt、Akt的陽性細胞數均顯著多于A組(P<0.01)，胞核中偶見棕黃色顆粒。C、D、E組中兩種蛋白的陽性細胞數明顯比B組增多(P<0.05)。且C、E組中兩種蛋白的陽性細胞數較D組增多(P<0.05)；C組中兩種蛋白的陽性細胞數雖多于E組，但無統計學差異(P>0.05)。見表1。

圖1　各組海馬CA1區神經元(HE，×200)

圖2　海馬CA1區Akt、p-Akt蛋白表達(SABC，×200)

表1　各組大鼠海馬區p-Akt、Akt陽性細胞計數

與A組相比：1)P<0.01；與B組相比：2)P<0.05；與D組相比：3)P<0.05

3討論

到目前為止主要還是應用抗癲癇藥物來控制癲癇發作，手術治療為輔，但無論是藥物治療還是手術治療都會對患者造成一定程度的不良影響，靈芝是一種珍貴的天然藥用真菌，其中主要含有三萜類、酶類及微量元素等近千種化合物〔3〕，其中三萜類、多糖類等具有生物學活性的成分已被分離、提取。最近研究發現，靈芝在抑制炎癥反應〔4〕、抗腫瘤〔5〕及調節人體糖代謝〔6〕等方面都發揮著一定功效，并且靈芝酸還可通過降低癇樣放電海馬神經元中ERK1/2的磷酸化水平從而達到保護海馬神經元的作用〔7〕。

PI3K/Akt信號通路是人體內重要的信號傳導通路，已被證實在多種疾病的發生、發展中都發揮著重要的作用，而p-Akt與Akt作為其通路中重要的下游蛋白，不僅可以促進神經元的存活還具有一定的抗凋亡作用〔8〕。Wortmannin作為PI3K/Akt信號通路的抑制劑，可抑制p-Akt與Akt的表達。本實驗說明靈芝酸對海馬神經元具有一定的保護作用。靈芝酸是通過PI3K/Akt途徑對海馬神經元起到保護作用的，其作用機制與PI3K/Akt通路有關，并在應用wortmannin后更加證實了這一點，這為以后抗癲癇藥物的研究提供了新的靶點。

4參考文獻

1Leppik IE.Wanted： a global campaign against epilepsy〔J〕.Lancet，2012;380(9848)：1121.

2Nadler JV.The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain〔J〕.Neurochem Res，2003;28(11)：1649-58.

3蔣麗，黃遠英，殷光玲.靈芝孢子油免疫調節作用的研究〔J〕.現代食品科技，2013;29(3)：531-3，542.

4李仲娟，楊朝令，楊細鳳，等.靈芝酸G對FcεR1α~+肥大細胞的活性影響〔J〕.時珍國醫國藥，2014;25(9)：2101-2.

5王健，楊元帥，王鋼，等.靈芝酸抗癌機制的分子模擬研究〔J〕.沈陽藥科大學學報，2012;29(11)：887-92.

6金德寬.靈芝酸對人體糖代謝調節作用的研究〔J〕.食品研究與開發，2012;33(11)：202-7.

7欒倩，劉蕾，劉君星，等.靈芝酸對癇樣放電海馬神經元ERK1/2磷酸化水平的影響〔J〕.黑龍江醫藥科學，2014;37(2)：1-3.

8史志勤，王維平，于江華，等.重組人紅細胞生成素經PI3K/Akt途徑對大鼠癲癇持續狀態誘導的神經元凋亡的保護作用〔J〕.中國組織化學與細胞化學雜志，2009;18(1)：94-102.

〔2013-12-17修回〕

(編輯苑云杰)