米諾環素保護大鼠缺血再灌注損傷腦作用的時間窗

米諾環素保護大鼠缺血再灌注損傷腦作用的時間窗

熊建忠易飛揭文妙

(萍鄉市人民醫院神經內科，江西萍鄉337000)

摘要〔〕目的觀察米諾環素對大鼠腦缺血再灌注后損傷的腦保護作用的時間窗。方法72只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、生理鹽水組、預處理組、30 min組、4 h組及12 h組，每組12只。采用線栓法制作大腦中動脈缺血再灌注模型。用免疫組織化學法、放射免疫法、RT-PCR、Hoechst染色評估腦缺血再灌注損傷后環氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2、白細胞介素-1β轉化酶(ICE)的表達及細胞凋亡的情況。用核磁共振DWI掃描及增強掃描觀察各組大鼠細胞性腦水腫及血管源性腦水腫情況。結果預處理組、30 min組、4 h組能明顯抑制缺血再灌注后COX-2、PGE2、ICE的表達，減輕細胞及血管源性腦水腫，抑制細胞凋亡。12 h組對腦缺血再灌注后COX-2、PGE2、ICE的表達，細胞及血管源性腦水腫及細胞凋亡無明顯抑制作用。結論米諾環素對腦缺血再灌注后腦損傷的保護作用有一定的時間窗。

關鍵詞〔〕米諾環素；缺血再灌注；腦保護；時間窗

中圖分類號〔〕R741〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：江西省科技計劃支撐項目(SBB01800)

第一作者：熊建忠(1974-)，男，博士，副主任醫師，主要從事腦血管疾病研究。

腦血管病致死致殘率非常高，缺血性腦血管病占腦血管病的70%左右。對于缺血性腦血管病目前尚無有效的治療手段。盡管有許多藥物在動物實驗中被證實有神經保護作用，但在臨床中試驗卻以失敗告終。臨床試驗失敗的原因不是毒副作用太大，就是治療時間窗太窄。因此廣大學者一直在尋找一種治療效果好，副作用少的神經保護藥。腦缺血再灌注后立即出現炎癥反應，腦水腫及細胞凋亡。因此如能抑制缺血后炎性反應，腦水腫及細胞凋亡將對缺血性腦損傷起到非常好的腦保護作用。米諾環素(MC)是一種半合成的第二代四環素衍生物。對革蘭陽性及革蘭陰性球菌等都有較好的抗菌作用。米諾環素較其他四環素類藥物具有較高親脂性，容易透過血腦屏障到達中樞神經系統。因而在神經系統疾病治療中發揮重要作用。最近在中樞神經系統動物模型中的研究表明MC具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等神經保護作用。本課題采用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，術后不同時段給大鼠腹腔注射MC，用免疫組織化學法、放射免疫法、RT-PCR、Hoechst染色評估腦缺血再灌注損傷后環氧化酶(COX)-2、前列腺素(PG)E2、白細胞介素-1β轉化酶(ICE)的表達及細胞凋亡的情況，采用核磁共振DWI掃描及增強掃描觀察各組大鼠腦水腫情況，探討其對腦缺血再灌注損傷后腦保護作用及時間窗。

1材料與方法

1.1材料雄性SD大鼠，體重250～300 g，中南大學動物實驗室。MC：中國惠式制藥有公司(批號:0812080)。ICE引物，上海生物工程技術有限公司合成。COX2檢測試劑盒：廣州森達生物科技公司。Hoechst33258液：上海碧云天生物技術有限公司。PGE2放射免疫試劑盒：北京華英生物技術有限公司。1.5T高場核磁共振：美國GE公司。熒光顯微鏡:日本Nikon公司。

1.2動物分組將72只雄性 SD大鼠隨機分為6組 ，每組12只 ，即假手術組(術后30 min腹腔注射MC 45 mg/kg)，生理鹽水組(大鼠缺血后 30 min腹腔注射生理鹽水)，預處理組(大鼠缺血前12 h腹腔注射MC 45 mg/kg)，30 min組(大鼠缺血后30 min腹腔注射MC 45 mg/kg)，4 h組(大鼠缺血后4 h腹腔注射MC 45 mg/kg)，12 h組(大鼠腦缺血后12 h腹腔注射MC45 mg/kg)。

1.3模型的制備采用改良的Zea Longa線栓法建立右側大腦中動脈閉塞再通模型，于缺血1.5 h后拔出線栓，形成腦缺血再灌注。假手術組(線栓插入深度為10 mm，不造成腦缺血)其余處理相同。

1.4核磁共振掃描采用GE1.5T超導MR成像設備，3英寸環形表面線圈為接收線圈。大鼠缺血再灌注24 h后核磁共振掃描。掃描參數：DWI：TR/TE/NEX =4 975/103/16，T1WI:TR/TE/NEX=1 835/12.4/6。增強掃描時從股靜脈留置針靜緩慢注入Gd-DTPA(0.2 mmol/kg)。注藥后10 min進行增強掃描。磁共振成像(MRI)原始數據傳入工作站，由同一名影像專業醫師在同一天進行分析。血管源性腦水腫的評價：選取包括兩側側腦室的層面為測量層面，在患側皮層和紋狀體區病灶中心及對側對應區分別測量感興趣區(ROI)的平均信號強度(SI)。以 Re表示增強掃描患側SI的變化率，Re=病側增強掃描SI/對側增強掃描SI×100%。細胞性腦水腫的測量，在DWI圖像上取3點興趣區，1點為中心區，3點為邊緣區，2點為第1、3點的中心點。計算平均擴散系數。計算時采用相對表現擴散系數 (rADC)=病側ADC值/健側相應區域ADC值×100%。然后比較各組的rADC。

1.5免疫組織化學染色大鼠缺血再灌注24 h后，用10%水合氯醛麻醉，等滲生理鹽水和4%多聚甲醛PBS液進行心臟灌注，斷頭取腦，取距嗅球尖端后7～11 mm間的腦組織塊，置于4%多聚甲醛中固定，脫水，包埋，連續切片，片厚 6 μm 。免疫組織化學染色嚴格按照說明書操作進行。染色成功后用高倍顯微鏡進行拍照，每張切片選取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析光密度值。

1.6PGE2水平測定大鼠麻醉后用等滲生理鹽水快速灌洗，斷頭取患側腦組織，分離額頂部皮質，置微型勻漿器中加0.1 ml 無水乙醇研磨，再加等滲生理鹽水0.9 ml充分研磨成勻漿，4℃離心3 500 r/min，15 min，取勻漿上清液200 μl，按放免試劑盒說明操作，測出樣品溶度。

1.7ICE mRNA檢測大鼠缺血再灌注24 h后，10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，取缺血半暗帶腦組織，迅速用液氮冷凍，并放置-70℃保存。RNA提取及引物合成提取采用異硫氰酸胍法：正義鏈引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，反義鏈引物：5'-TGG TGT GGA AGA GCA GAA AGC-3'；γ-actin正義鏈引物5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，反義鏈引物：5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'。逆轉錄及cDNA擴增，參考文獻方法進行，ICE擴增28個循環。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。通過圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的灰度值，以ICE基因片段與相應模板GAPDH片段灰度值的比值作為其mRNA相對表達水平數值。

1.8Hoechst染色切片常規脫蠟透明后，置于6孔板上以0.9%生理鹽水洗3遍，每次3 min，吸盡液體，然后加入0.5 ml的Hoechst 染色液，手搖晃動以充分染色，染色5 min，完成后將切片置于載玻片上，滴上1滴抗淬滅液，蓋上潔凈的蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察神經細胞凋亡形態并進行拍照。并計算出細胞凋亡百分率。

1.9統計學處理采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，方差齊用Bonferroni法，方差不齊采用Welch法和Dunnett'3法。

2結果

2.1COX-2免疫組化表達假手術組可見少量COX-2陽性細胞。生理鹽水組缺血灶周圍可見大量COX-2 染色陽性細胞。與假手術組相比，其平均光密度值增高(P<0.05)。與生理鹽水組相比，預處理組、30 min、4 h組平均光密度值下降(P<0.05)。12 h組COX-2光密度值下降不明顯，與生理鹽水組相比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

2.2PGE2的表達假手術組只有少量PGE2表達，生理鹽水組PGE2表達明顯增高，預處理組30 min、4 h組PGE2表達水平相對于生理鹽水組有明顯下降(P<0.05)。12 h組PGE2含量與假手術組相比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3ICE的表達假手術組大鼠的大腦皮層只有少量ICE表達，生理鹽水組在缺血半暗帶ICE表達增強。與生理鹽水組相比，預處理組、30 min、4 h組ICE的表達降低(P<0.05)，12 h組ICE的表達無明顯下降(P>0.05)。見表1。

2.4磁共振彌散加權成像假手術組磁共振DWI掃描無異常信號，生理鹽水組DWI掃描可見大片異常信號區，rADC值下降，與假手術組相比，差異有統計學意義。各模型組DWI掃描均可見高信號區，預處理組、30 min組rADC有所上升，與生理鹽水組相比差異顯著(P<0.05)。與生理鹽水組相比，4、12 h組rADC值亦有相應上升。見表2，圖1。

2.5核磁共振T1WI增強掃描假手術組T1WI增強掃描無異常表現，各模型組增強掃描后均出現不同程度的強化。與假手術組相比，生理鹽水組增強掃描可見強化，相對信號強度增高。預處理組，30 min組、4 h增強掃描后其信號強度與生理鹽水組相比有所下降，差異有統計學意義。12 h組與生理鹽水組相比增強掃描信號強度無明顯下降(P>0.05)。見表2，圖1。

2.6Hoechst染色結果與假手術組相比，假手術組大腦皮層只有少量凋亡細胞，生理鹽水組在腦缺血灶周圍中可見大量凋亡細胞(P<0.05)。預處理組、30 min、4 h組細胞凋亡百分率下降，與生理鹽水組相比差別有統計學意義(P>0.05)。與生理鹽水組相比，12 h組細胞凋亡百分率無明顯下降(P>0.05)。見表2，圖1。

表1　各組大鼠的COX-2光密度值、PGE2的含量、

與生理鹽水組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表2　各組大鼠增rADC值、強掃描相對信號強度、

COX-2表達(×400)

DWI掃描圖

增強掃描圖

Hoechst染色

3討論

神經元凋亡是一種多基因控制的細胞主動死亡過程，在不同刺激信號的影響下，涉及多個基因表達及相互作用的復雜過程。ICE是Caspase家族中最早克隆的凋亡相關基因。ICE能使IL-1β前體轉化成為成熟形式，成熟的IL-1β促進凋亡的發生，是凋亡的增強因子〔1〕。Hoechst染色后在熒光顯微鏡下能迅速區分出正常細胞與凋亡細胞，被廣泛地用于細胞凋亡研究。近來動物模型研究發現米諾環素具有抗微生物特性外，還具有細胞凋亡等作用〔2〕。

本實驗結果進一步證實MC在腦缺血前后一定時間段給藥具有抗細胞凋亡作用，與Arvin等〔3〕研究結果相一致。

MC的抗凋亡作用可能與阻止細胞內鈣離子(Ca2+)超載、細胞色素C和Smac/Diablo的釋放，縮小線粒體的皺縮和腫脹，抑制線粒體的死亡有關。同時MC還能抑制ICE的表達及ICE的活性；另外米諾環素還能抑制小膠質細胞激活，穩定線粒體膜，減少線粒體對細胞色素C(Cyt-C)，Smac/Diablo和AIF的通透性〔4〕，上調抗凋亡因子bcl-2〔5〕。

腦缺血引起的腦水腫是影響病人急性期與亞急性期生存的重要因素。 腦缺血再灌注損傷后導致的腦水腫，涉及多種因素，多個環節，其中炎性反應，自由基的形成，金屬基質蛋白酶的活化在缺血后腦水腫起重要作用。

MRI是腦缺血的神經保護藥物療效監測、作用效果對比等研究一種簡單、有效且實用的方法〔6〕。DWI對急性腦缺血非常敏感，是評價腦缺血后細胞性水腫的一個很好指標。急性腦缺血區DWI信號直接與ADC值有關，兩者呈反比，即ADC值越低，DWI信號越高；ADC值越高，DWI信號越低。Gd-DTPA是一種順磁性金屬離子螯合物。正常腦組織中，靜脈注射的順磁性造影劑Gd-DTPA不能通過血腦屏障(BBB)，只有在BBB完整性破壞時，T1WI增強掃描才會出現信號強化，其強化范圍和信號強度均反映出BBB的受損情況。本研究結果進一步表明，在腦缺血前后一定時間段內給予MC能減輕腦缺血再灌注損傷后腦水腫。MC在腦缺血再灌注損傷中抑制腦水腫的作用機制可能是：抑制氧自由基的形成〔7〕；抑制基質金屬蛋白酶的活性；MC能結合Ca2+及鋅離子(Zn2+)，從而抑制了依賴這些離子的膠原酶〔8〕；MC還能減少基質金屬蛋白(MMP)-9的產生，從而減輕腦水腫〔9〕；MC還通過抗炎作用起到抑制腦缺血再灌注后腦水腫〔10〕。

缺血性腦血管疾病存在一系列的腦組織損傷、細胞致死過程。目前越來越多的證據表明，炎癥在缺血性腦卒中的發生和發展中具有關鍵作用。腦梗死后炎性因子包括COX-2、PGE2、腫瘤壞死因子等。研究表明COX-2、PGE2參與了腦缺血后腦損傷的發生、發展 ，并與腦缺血的預后關系密切。本組數據顯示生理鹽水組，COX-2，PGE2的表達較假手術組明顯增多，MC預處理組，30 min組、4 h組均能明顯降低COX-2、PGE2的表達，以預處理組及30 min組效果明顯。12 h不能降低COX-2、PGE2的表達。米諾環素抑制腦缺血后炎性反應可能是通過抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，減少一氧化氮的產生，抑制還原型輔酶Ⅱ氧化酶的活性，降低缺血后COX-2的表達及腦組織內PGE2的含量〔11〕；另外MC還具有抑制小膠質細胞(MG)細胞的激活及其與T細胞的交互作用，降低了T細胞接觸MG的能力，從而減少小膠質細胞釋放或分泌一些炎性因子和酶類，達到抑制腦缺血后炎性反應的作用〔10〕。減少炎性因子的釋放達到抑制炎性反應的作用。

本研究提示米諾環素對神經系統疾病有一定的保護作用，其作用機制不是單一的，而是多因素多途徑的。相信隨著研究的深入，米諾環素的神經保護作用機制會得到更好的解釋，米諾環素有可能成為治療神經系統疾病新的有效藥物。米諾環素對缺血后腦保護作用有一定的時間窗，在缺血前12 h，缺血后30 min給藥效果最好。腦缺血后12 h給藥，效果不佳。但目前對米諾環素的研究大多停留在動物實驗階段，其臨床效果及最佳作用時間還需要更多的實驗證實。

參考文獻4

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〔2013-09-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)