瑞舒伐他汀對大鼠心肌梗死后細胞凋亡及對線粒體融合素2表達的影響

瑞舒伐他汀對大鼠心肌梗死后細胞凋亡及對線粒體融合素2表達的影響

周煒陳玲周逸陳曼華

(武漢市中心醫院心血管內科，湖北武漢430014)

摘要〔〕目的研究不同劑量瑞舒伐他汀對大鼠心肌梗死后細胞凋亡及線粒體融合素2蛋白表達的影響。 方法選取雄性SD大鼠48只，隨機分為假手術組(Sham)，心肌梗死組(MI)，瑞舒伐他汀1組(Statin 1)和瑞舒伐他汀2組(Statin 2)，每組12只。Statin 1組術前7 d開始每日給予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，Statin 2組藥物劑量為每日20 mg/kg，MI組以蒸餾水灌胃，隨后制備心肌梗死模型。術后24 h采用脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡，免疫印跡法檢測磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的表達，免疫組化法檢測線粒體融合素2的表達。 結果與Sham組相比，MI組及Statin 1組、2組心肌細胞凋亡顯著增加，p-Akt表達顯著下降，線粒體融合素2表達顯著增加(P<0.01)；與MI組相比，Statin 1組、2組心肌細胞凋亡和線粒體融合素2表達均顯著降低(P<0.05)，而p-Akt表達顯著增高(P<0.05)，且Statin 2組較1組變化更顯著(P<0.05)。結論瑞舒伐他汀可抑制大鼠心肌梗死后的細胞凋亡，其作用可能與抑制線粒體融合素2表達有關。

關鍵詞〔〕瑞舒伐他汀；心肌梗死；凋亡；線粒體融合素2基因

中圖分類號〔〕R541.4〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：武漢市衛生局臨床醫學科研項目(WX12B03)；武漢市科技局關鍵技術攻關計劃(2013060602010256)

通訊作者：陳曼華(1962-)，女，主任醫師，主要從事冠心病的介入治療研究。

第一作者：周煒(1979-)，男，博士，主治醫師，主要從事動脈粥樣硬化的發病機制及基因治療研究。

心肌細胞凋亡是引起心肌梗死后心功能不全、心室重塑及心律失常的重要原因〔1〕。目前發現，他汀類藥物可通過原癌基因Ras法尼基化的相關機制誘導磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路激活，發揮其調節細胞增殖和凋亡、抗動脈粥樣硬化、心肌保護等調脂外作用〔2,3〕。線粒體融合素2(Mfn2)是利用差異顯示法從自發性高血壓大鼠體內克隆獲得的基因，其表達產物可負向調控PI3K/Akt信號通路，誘導細胞凋亡〔4〕。目前關于他汀類藥物對Mfn2的調節作用尚不明確。因此，本實驗建立大鼠急性心肌梗死模型，觀察瑞舒伐他汀對心肌細胞凋亡及Mfn2表達的影響，進一步闡明其抗心肌細胞凋亡的機制。

1材料與方法

1.1主要儀器和試劑小動物呼吸機(HX-300S型，成都泰盟科技有限公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，高清晰度數字視屏顯微鏡(日本Nikon公司)；凋亡檢測(TUNEL)試劑盒(德國Roche公司)；Mfn2抗體(英國Abcam公司)，p-Akt抗體、Akt抗體、α-肌動蛋白(α-actin)抗體，辣根過氧化物酶標記的二抗(美國Cell signaling公司)。免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色液(武漢博士德公司)；瑞舒伐他汀(阿斯利康制藥有限公司)。其他的試劑采用國產分析純試劑。

1.2實驗分組選取健康雄性SD大鼠48只，體重(250±30)g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。實驗分為假手術組(Sham)；心肌梗死組(MI)；瑞舒伐他汀1組(Statin 1)；瑞舒伐他汀2組(Statin 2)，共4組，每組12只。Statin 1組術前7 d開始每日給予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，Statin 2組藥物劑量為20 mg/kg，劑量的選擇參考文獻〔5〕。Sham組及MI組予等量蒸餾水灌胃。

1.3建立大鼠MI模型參照文獻進行〔1〕。3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，小動物呼吸機鼻面罩輔助通氣。調整呼吸機參數：潮氣量6~8 ml/kg，呼吸頻率70~80次/min，吸呼比1∶2。開胸后分離胸膜、心包，在左心耳下緣、肺動脈圓錐水平結扎左前降支。造模成功的標準為：①心電圖標準Ⅱ導聯ST段呈弓背向上型抬高，②結扎動脈遠端心肌出現蒼白。假手術組開胸后于左前降支下穿線，不結扎。各組存活至術后24 h的動物數量分別為Sham組(12只)，MI組(9只)，Statin 1組(10只)，Statin 2組(10只)。處死大鼠后取心臟標本，4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋后切片。

1.4缺口末端標記法(TUNEL)染色檢測心肌細胞凋亡按試劑盒操作說明染色，以細胞核染成棕黃色為陽性，每張切片在梗死邊緣區域(Sham組在左室前壁)隨機取5個高倍鏡視野，記錄陽性細胞數，計算凋亡指數(AI)，AI(%)=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%，每張切片取5個視野求均值。

1.5免疫組化法檢測Mfn2蛋白表達按試劑盒說明操作檢測Mfn2蛋白表達。每張切片在梗死邊緣區域(Sham組在左室前壁)隨機選取5個高倍鏡視野，虛擬顯微鏡拍攝圖像，使用Image pro-Plus圖像分析軟件測定Mfn2蛋白表達平均光密度值(MOD)。

1.6免疫印跡法檢測p-Akt的表達提取組織總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白上樣量為50 μg，經電泳、轉膜、封閉后，將膜在一抗(抗β-actin、抗p-Akt、抗Akt)中4℃孵育過夜。緩沖液洗脫后放入辣根過氧化物酶標記的二抗中室溫孵育2 h后進行檢測。Quantity One軟件測定條帶灰度值，進行半定量分析。

2結果

2.1各組心肌細胞凋亡的分布經TUNEL染色及蘇木素復染后凋亡細胞核呈棕黃色，正常細胞核呈藍色。Sham組心肌細胞未見明顯凋亡；與MI組比較，瑞舒伐他汀1組、2組AI均顯著下降(P<0.05)，且瑞舒伐他汀2組較1組AI降低更顯著(P<0.05)，見圖1和表1。

2.2各組心肌組織p-Akt的表達及灰度分析免疫印跡法顯示，與Sham組比較，MI組及Statin1組、2組心肌組織中p-Akt蛋白表達均顯著降低(P<0.01)；與MI組比較，Statin1組、2組p-Akt表達顯著增加(P<0.05)，且Statin2組較1組表達更高(P<0.05)，見圖2和表1。

2.3各組心肌組織Mfn2蛋白的表達及光密度分析Sham組未見明顯梗死區域，Mfn2蛋白少量表達；與Sham組比較，MI組及Statin1組、2組在心肌梗死邊緣區域Mfn2蛋白表達均顯著增加(P<0.01)；與MI組比較，Statin1組、2組Mfn2表達顯著降低(P<0.05)，且Statin2組較1組表達更低(P<0.05)，見圖3和表1。

圖1　各組TUNEL染色結果(×400)

組別nAIp-Akt灰度相對比值Mfn2光密度值Sham組120.00±0.0082.35±5.188.14±1.34MI組961.38±6.341)9.36±0.171)49.52±3.291)Statin1組1037.25±3.571)2)17.82±1.371)2)33.61±2.071)2)Statin2組1024.46±3.131)2)3)25.43±2.561)2)3)24.18±1.931)2)3)

與Sham組比較：1)P<0.01，與MI組比較：2)P<0.05，與Statin 1組比較：3)P<0.05

A.Sham組；B.MI組；C.Statin 1組；D.Statin 2組 圖2　各組免疫印跡法檢測結果

圖3　各組免疫組化染色結果(DAB，×200)

3討論

心肌細胞凋亡是急性心肌梗死早期細胞丟失的重要形式，并參與慢性心力衰竭的病理生理過程。急性心肌梗死發生時，缺血、缺氧以及活性氧(ROS)產生增加等多種因素激活促凋亡基因，通過調控相關的信號通路誘導心肌細胞凋亡。其中，Ras-PI3K/Akt信號通路是促發心肌細胞凋亡的關鍵路徑〔6〕。因此，通過藥物或基因治療干預凋亡相關基因的表達，調控細胞內信號傳導通路，抑制細胞凋亡，有可能成為防治心肌梗死的有效手段。

他汀類藥物是目前臨床應用最廣泛的調脂藥物，其具有多重調脂以外的作用。研究發現，他汀類藥物通過抑制甲羥戊酸合成，使其下游的焦磷酸法尼酯和焦磷酸牛兒基牛兒酯減少，阻礙小三磷酸鳥苷結合蛋白Ras、Rho、Rac等異戊二烯化，影響Ras-PI3K/Akt及絲裂原活化的蛋白激酶信號通路、腎素-血管緊張素系統和過氧化物酶增殖物激活受體的活性，增加一氧化氮水平，減少ROS產生，因此具有保護血管內皮細胞、抗氧化應激及抗炎、抗心肌肥厚等調脂外作用〔2,3,7〕。本研究發現，術前7 d開始每日給予瑞舒伐他汀可顯著抑制大鼠急性心肌梗死后的細胞凋亡，且具有一定的劑量依賴性。

Mfn2是一種線粒體外膜蛋白，廣泛分布于人體的心、腎、腦、肺、肝等不同組織中，尤以心臟和腎最為豐富，對線粒體融合、線粒體形態及功能的調節有重要作用〔4〕。Mfn2也是細胞信號傳導通路中一個新的調控點，對細胞增殖和凋亡有重要的調節作用。該基因是原癌基因Ras的直接負調控因子，能夠與其相互作用，阻滯Ras-PI3K/Akt信號通路，顯著抑制Akt的磷酸化水平，進而減少Bcl-2蛋白表達，增加Bax蛋白表達，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，其作用與線粒體融合無關〔8,9〕。有研究發現，氧化應激誘導心肌細胞凋亡時Mfn2表達上調，過表達Mfn2通過上述通路誘導心肌細胞凋亡〔10〕。本研究發現，大鼠發生急性心肌梗死后，局部組織Mfn2表達顯著增高，p-Akt表達顯著降低，表明Akt磷酸化受到抑制，提示缺血缺氧損傷激活了Mfn2的表達，從而促發心肌細胞凋亡增加。而瑞舒伐他汀干預則可顯著下調Mfn2表達，進而促進Akt磷酸化，抑制心肌細胞凋亡，作用呈一定的劑量依賴性。

本文研究結果顯示，Mfn2基因可能是大鼠心肌梗死過程中一個重要的促凋亡基因，參與瑞舒伐他汀抑制心肌梗死后細胞凋亡的過程，也是瑞舒伐他汀發揮其心肌保護作用的一個重要靶基因，其具體機制有待進一步深入研究。

4參考文獻

1Bhushan S,Kondo K,Predmore BL,etal.Selective β2-adrenoreceptor stimulation attenuates myocardial cell death and preserves cardiac function after ischemia-reperfusion injury〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012;32(8):1865-74.

2Tanaka S,Fukumoto Y,Nochioka K,etal.Statins exert the pleiotropic effects through small GTP-binding protein dissociation stimulator upregulation with a resultant Rac1 degradation〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013;33(7):1591-600.

3Song XJ,Yang CY,Liu B,etal.Atorvastatin inhibits myocardial cell apoptosis in a rat model with post-myocardial infarction heart failure by downregulating ER stress response〔J〕.Int J Med Sci,2011;8(7):564-72.

4Zhou W,Chen KH,Guo XM,etal.Mutation of the protein kinase A phosphorylation site influences the anti-proliferative activity of mitofusin 2〔J〕.Atherosclerosis,2010;211(1):216-23.

5Preusch MR,Vanakaris A,Bea F,etal.Rosuvastatin reduces neointima formation in a rat model of balloon injury〔J〕.Eur J Med Res,2010;15(11):461-7.

6Ishihara Y,Shimamoto N.Sulfaphenazole attenuates myocardial cell apoptosis accompanied with cardiac ischemia-reperfusion by suppressing the expression of BimEL and Noxa〔J〕.J Pharmacol Sci,2012;119(3):251-9.

7Davignon J,Mabile L.Mechanisms of action of statins and their pleiotropic effects〔J〕.Ann Endocrinol (Paris),2001;62(1 Pt 2):101-12.

8Guo XM,Chen KH,Guo YH,etal.Mitofusin 2 triggers vascular smooth muscle cell apoptosis via mitochondrial death pathway〔J〕.Circulation Res,2007;101(8):1113-22.

9周煒，曹文靜，陳莉莉，等.去除蛋白激酶A磷酸化位點的線粒體融合素2基因對血管平滑肌細胞凋亡的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志,2012;20(11):968-71.

10Shen T,Zheng M,Cao CM,etal.Mitofusin-2 is a major determinant of oxidative stress-mediated heart muscle cell apoptosis〔J〕.J Biol Chem,2007;282(8):23354-61.

〔2013-12-05修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)