AMPK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

AMPK信號(hào)通路在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

梁新華李英1張蕾

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，新疆烏魯木齊830011)

摘要〔〕目的探討AMP激活的蛋白激酶(AMPK)及其下游信號(hào)通路分子雷帕霉素靶蛋白(mTOR)與高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(TEMT)間的關(guān)系。方法采用HG-DMEM培養(yǎng)基(含D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基)、AMPKα亞基特異激活劑AICAR和AMPK特異siRNAs處理腎小管上皮細(xì)胞(HK)-2細(xì)胞。采用Western印跡檢測(cè)HK-2細(xì)胞中AMPK及其下游信號(hào)通路分子mTOR的磷酸化活化水平。采用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HK-2細(xì)胞中與EMT相關(guān)的生物標(biāo)志物α-SMA和E-鈣黏蛋白的變化情況。結(jié)果同0 mmol/L的D-葡萄糖處理組相比，10、20和30 mmol/L的D-葡萄糖均可顯著抑制HK-2細(xì)胞中AMPK的磷酸化活化水平，并上調(diào)HK-2細(xì)胞中mTOR的磷酸化活化水平，且這種作用具有計(jì)量依賴性。同時(shí)D-葡萄糖可促進(jìn)HK-2細(xì)胞中EMT相關(guān)的生物標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)。 AMPKα亞基特異激活劑處理HK-2細(xì)胞可部分抵消促D-葡萄糖處理所致的EMT作用，AMPK特異siRNAs敲低HK-2細(xì)胞中AMPK表達(dá)后，可抵消AMPKα亞基特異激活劑抑制D-葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT的作用。結(jié)論D-葡萄糖通過(guò)抑制AMPK通路，上調(diào)AMPK下游mTOR通路，從而促進(jìn)HK-2細(xì)胞EMT作用。

關(guān)鍵詞〔〕D-葡萄糖；腎小管上皮細(xì)胞；間質(zhì)轉(zhuǎn)化；腺苷活化蛋白激酶；雷帕霉素靶蛋白

中圖分類號(hào)〔〕R587.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科

第一作者：梁新華(1972-),女,副主任醫(yī)師,主要從事各種原發(fā)、繼發(fā)性腎小球疾病、慢性腎臟病的治療及腹膜透析研究。

糖尿病腎病(DN)最終可導(dǎo)致終末期腎臟疾病〔1〕。高血糖是引起DN的一個(gè)主要因素，誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(TEMT)加速腎臟纖維化是DN發(fā)病的潛在機(jī)制之一〔2〕。據(jù)報(bào)道， AMP激活的蛋白激酶(AMPK)可參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性、血管生成、抑制血管炎癥等〔3〕。文獻(xiàn)報(bào)道，AMPK還具有抑制心臟和肝纖維化的功能〔4〕。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，被認(rèn)為是AMPK下游分子，AMPK通過(guò)調(diào)控mTOR磷酸化水平進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞功能。然而，關(guān)于AMPK/mTOR通路在高糖誘導(dǎo)的TEMT中的作用還很少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要針對(duì)AMPK/mTOR通路在D-葡萄糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)細(xì)胞TEMT中所起的作用進(jìn)行探討。

1材料與方法

1.1HK-2細(xì)胞培養(yǎng)及處理HK-2細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開始實(shí)驗(yàn)?；罨瘜?shí)驗(yàn)中采用含0、10、20和30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基及含30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基處理HK-2細(xì)胞0、6、12 h和24 h。

1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基及FBS購(gòu)自Gibco公司；CytoBuster 蛋白提取試劑購(gòu)自Novagen公司；蛋白酶磷酸酶抑制劑購(gòu)自Thermo公司；AMPK特異siRNAs購(gòu)自Qiagen公司；p-AMPK、p-mTOR、α-SMA、E-鈣黏蛋白和Actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Lonza公司。

1.3細(xì)胞總蛋白提取實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞以預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，400 r/min離心，8 min；棄去PBS，加入1 μl蛋白酶磷酸酶抑制劑和10 μL CytoBuster 蛋白提取試劑，混勻后室溫放置15 min；4°C，12 000 r/min 離心15 min；吸取上清部分即細(xì)胞總蛋白。

1.4Western印跡上述蛋白經(jīng)10%十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離膠和5%濃縮膠分離后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至聚氟偏乙稀羊滑肌肌動(dòng)蛋白(PVDF)膜上，PVDF膜以含5%Tris鹽酸緩沖液(BSA)的TBST室溫封閉2 h，加入p-AMPK、p-mTOR、平滑肌肌勸蛋白(α-SMA)、E-鈣黏蛋白和Actin抗體，4℃過(guò)夜孵育。第2天以0.1% TBST 洗膜3 次，5 min/次，加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h。以0.1% TBST 洗膜3 次，5 min/次，PVDF膜以Supersignal West Femto HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。

1.5免疫熒光實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)與載破片上的細(xì)胞以4%多聚甲醛固定15 min，隨后用0.2%Triton X-100進(jìn)行穿透，用含2%BSA的PBS室溫阻斷1 h。加入α-SMA、E-鈣黏蛋白抗體4℃過(guò)夜孵育。第2天洗片后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。洗片后采用4，6-聯(lián)腺-2苯基吲哚(DAPI)復(fù)染核。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞中AMPK、mTOR蛋白磷酸化水平的作用隨著D-葡萄糖濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HK-2細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐漸降低。mTOR蛋白磷酸化水平逐漸升高，見(jiàn)圖1，圖2。

2.2D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞中α-SMA和E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響D-葡萄糖可促進(jìn)HK-2細(xì)胞中EMT相關(guān)的生物標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，并抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖3。

圖1　D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影響

圖2　D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞中mTOR蛋白磷酸化水平的影響

圖3　D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞中α-SMA和 E-鈣黏蛋白表達(dá)的影響(×400)

2.3AMPKα亞基特異激活劑5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)和AMPK特異siRNAs對(duì)D-葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT的影響AMPKα亞基特異激活劑處理HK-2細(xì)胞后，可部分抵消促D-葡萄糖處理所致的EMT作用，AMPK特異siRNAs敲低HK-2細(xì)胞中AMPK表達(dá)后，可抵消AMPKα亞基特異激活劑抑制D-葡萄糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT的作用。見(jiàn)圖4。

A：對(duì)照；B：D-葡萄糖；C：D-葡萄糖+AICAR；D：D-葡萄糖+AICAR+siRNA 圖4　AMPKα亞基激活劑AICAR和AMPK特異siRNAs對(duì) HK-2細(xì)胞中α-SMA和E-鈣黏蛋白表達(dá)影響

3討論

藥物通過(guò)控制血糖水平，對(duì)腎臟發(fā)揮保護(hù)作用，從而延緩腎衰的進(jìn)展，但無(wú)法完全阻止DN的發(fā)展〔5〕。DN發(fā)病機(jī)制是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，至今尚未完全研究清楚。已知高血糖可通過(guò)TEMT加速腎臟纖維化，這一過(guò)程是DN發(fā)病的潛在機(jī)制之一〔2〕。然而高血糖是如何調(diào)控TEMT發(fā)生的目前還有待進(jìn)一步的深入研究。

AMPK是一種保守的異源三聚體蛋白質(zhì)激酶，在接受外源信號(hào)刺激被激活后，即可向下游傳遞信號(hào)，激活下游通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為〔6〕。文獻(xiàn)報(bào)道，AMPK具有抑制心臟和肝纖維化的功能〔4〕。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，其信號(hào)接收并整合細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、凋亡等生理過(guò)程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔7〕。研究提示mTOR是AMPK下游的信號(hào)通路分子，AMPK通過(guò)調(diào)控mTOR的活化水平對(duì)細(xì)胞的凋亡發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果提示D-葡萄糖可能通過(guò)調(diào)控AMPK信號(hào)通路的活化情況，進(jìn)而促進(jìn)HK-2細(xì)胞EMT的發(fā)生。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK-2細(xì)胞中α-SMA和E-鈣黏蛋白的表達(dá)與單獨(dú)的D-葡萄糖處理組相似?？傊?，D-葡萄糖可通過(guò)調(diào)節(jié)HK-21細(xì)胞中的AMPK/mTOR通路的活化情況，從而促進(jìn)TEMT的發(fā)生。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-03-28修回〕

(編輯袁左鳴)