補陽還五湯對動脈粥樣硬化大鼠細胞間黏附分子-1表達的影響

補陽還五湯對動脈粥樣硬化大鼠細胞間黏附分子-1 表達的影響

呂永恒黎洪展肖衛輝吳曉偉陳鐵明

(南方醫科大學中西醫結合醫院，廣東廣州510315)

摘要〔〕目的研究補陽還五湯對動脈粥樣硬化(AS)大鼠細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達的影響。方法采用高膽固醇飼料喂飼建立大鼠AS模型并予補陽還五湯干預。測定各組內膜增生情況，免疫組化觀察內膜粥樣硬化斑塊中ICAM-1的表達。結果補陽還五湯組內膜增生較模型組明顯減輕(P<0.05)。補陽還五湯組ICAM-1表達較模型組明顯減少(P=0.019)。結論補陽還五湯能顯著改善大鼠AS水平；可明顯抑制ICAM-1表達，此可能為其防治AS的機制之一。

關鍵詞〔〕補陽還五湯；動脈粥樣硬化；細胞間黏附分子

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：廣東省中醫藥局項目(No.20121122)

通訊作者：黎洪展(1973-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事心腦血管疾病研究。

第一作者：呂永恒(1971-)，男，副主任醫師，碩士，主要從事心血管疾病研究。

研究認為動脈粥樣硬化(AS)過程不僅僅是脂質在動脈壁中的聚積，而且是一種慢性炎癥性疾病，多種炎性細胞因子的過度釋放是其重要機制〔1〕。已有研究發現細胞間黏附分子-1(ICAM-1)參與了AS的形成過程〔2〕。活血、益氣、化痰是中醫治療冠心病的常用方法，補陽還五湯是收載于《醫林改錯》中的經典方劑，具有益氣活血、通經活絡的功效，已有研究認為補陽還五湯具有抗AS作用〔3〕。本研究探討補陽還五湯對試驗性大鼠AS形成及主動脈ICAM-1表達的影響。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器ICAM-1單克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司；即用型SABC免疫組化試劑盒(含生物素標記山羊抗兔/大鼠IgG二抗和辣根過氧化物酶標記鏈霉菌卵白素工作液)和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；荷蘭威圖全自動生化分析儀；LeicaRM2125切片機和LeicaDME321058943PX顯微攝像機由德國徠卡公司生產；OLYMPUSCH20BIMF200-2顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備補陽還五湯依原方組成，其中黃芪120 g，川芎15 g，當歸15 g，赤芍15 g，桃仁12 g，紅花12 g，地龍10 g。將上述藥物用水煎煮3次，時間分別為1.5 h、1 h和45 min。合并煎煮液后濃縮成含生藥相當于2.5 g/ml，分裝，-80℃保存備用。

1.2.2 動物分組及給藥健康SD雄性大鼠30只，體質量(280±20)g。將大鼠隨機分為三組：對照組、模型組、補陽還五湯組，每組10只。大鼠分組后，對照組為普通飲食；模型組、補陽還五湯組飼以高脂飲食參照文獻方法造模，其飼料配制是：4%膽固醇、10%豬油、0.2%甲基硫氧嘧啶、86%基礎飼料，基礎飼料中面粉20%，米粉2%、玉米20%、麩皮25%、豆料20%、骨粉2%、魚粉2%；補陽還五湯組同時予補陽還五湯煎劑，其中第1～2周通過灌胃給藥，以后拌入正常飼料中，每鼠每天經上午、下午兩次給藥，日總量相當于含生藥5 g/kg(相當于體重為70 kg的成人用量)12 w后實驗。

1.2.3 主動脈病變病理檢查及主動脈內膜增生測定將胸主動脈段血管標本浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察主動脈病理形態學改變。每片隨機取3個視野，用MIASE醫學圖像分析管理系統測血管內膜厚度、內膜中膜厚度比及內膜面積/(內膜面積+中膜面積)比值即內膜增生指數。

1.2.4 主動脈ICAM-1免疫組織化學染色在胸主動脈中段定位切取2 mm×5 mm組織，制石蠟切片，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次3 min，按免疫組化試劑盒說明進行免疫組化染色，在顯微鏡高倍視野下觀察分析陽性結果，采用圖像分析系統，以陽性表達的百分率半定量分析ICAM-1表達的強弱。

1.3 統計學方法采用SPSS10.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1 主動脈病理學改變肉眼可見對照組內膜光滑，無斑塊形成。高脂模型組血管表面不光滑，凹凸不平，大量黃白色斑塊突出于管腔表面，并連接成片，尤以近主動脈弓處及血管開口處最為明顯。HE 染色可見模型組的內膜顯著增厚，內膜不完整，內皮下腔隙增大，內含大量泡沫細胞，中彈力纖維增粗，彈力纖維和膠原纖維排列紊亂。補陽還五湯組主動脈內膜厚度較模型組顯著變薄，病理改變減輕，只偶有少量的脂質沉積、散在的泡沫細胞和炎癥細胞。與對照組相比，模型組管腔面積減小、新生內膜面積增大、內膜增生百分比增大(P<0.001)。與模型組相比，補陽還五湯組管腔面積增大、新生內膜面積減小、內膜增生百分比減小(P<0.05)。見表1。

2.2 主動脈ICAM-1免疫組化檢測ICAM-1在模型組的表達為(3.67±0.43)%，較對照組的(0.55±0.25)%明顯增高(F=15.34，P=0.002)，ICAM-1在補陽還五湯組的表達為(1.29±0.52)%，較模型組降低(F=8.69，P=0.019)。見圖1。

表1　各組主動脈內膜增生情況比較 ± s, n=10)

1)模型組與對照組比較；2)模型組與補陽還五湯組比較

圖1　各組大鼠主動脈ICAM-1的表達(DAB，×200)

3討論

中醫研究認為AS斑塊的形成與氣虛、血瘀、痰阻密切相關，有黏、濃、凝、聚的特點，以氣虛血瘀證型最為常見，益氣活血能明顯改善臨床癥狀，尤其可以改善高危人群的生活質量，延長生存期，降低致殘率和死亡率，因此活血化瘀一直是AS中醫藥防治研究的熱點。中醫學界AS的認識與現代醫學的免疫炎癥機制有一定關聯，探討二者之間的內在聯系，可以為中醫治療AS提供思路〔4，5〕。

本文用高脂高膽固醇飼養成功建立了動脈粥樣硬化模型，其主要表現為血脂升高，大動脈及冠狀動脈內皮下脂質浸潤，管腔面積減小、新生內膜面積增大、內膜增生百分比增大等病理改變。加飼補陽還五湯的動物受累血管病變程度輕、管腔面積增大、新生內膜面積減小、內膜增生百分比減小，說明具有補氣活血、通經活絡功能的補陽還五湯具有抗AS形成的作用。

ICAM-1屬于黏附分子免疫球蛋白超家族，廣泛分布在體內的各種組織細胞的表面，其中以血管內皮細胞表面的表達最強。正常情況下內皮細胞中的ICAM-1表達很低，在內皮細胞缺血、再灌注損傷情況下，大量炎性遞質、細胞因子等能誘導ICAM-1蛋白及mRNA 的表達，參與T細胞反應、促進單核細胞與內皮細胞的黏附等。在動脈粥樣硬化形成過程中，首先是血管內皮受損，ICAM-1等表達增加，調節白細胞的黏附及穿越內皮的游移，隨后單核細胞到內皮下，攝取氧化修飾低密度脂蛋白，變為激活的巨噬細胞，最終成為泡沫細胞〔6〕。ICAM-1在AS病人的脂紋和纖維斑塊中大量表達是AS早期的病理變化及斑塊進展的潛在機制，并與AS的嚴重程度有關〔7〕，ICAM-1不僅有助于斑塊的形成，而且同斑塊的穩定性有關〔8〕。抑制ICAM-1的表達，可以減輕或延緩AS病變的發生和發展〔9〕。本研究發現，AS模型組主動脈可見大量ICAM-1陽性表達細胞，并且主要表達于病變血管的內皮及斑塊中，而補陽還五湯能明顯抑制AS大鼠主動脈ICAM-1的表達，從而抑制了AS時炎癥細胞趨化、黏附與遷移，抑制AS時局部炎癥反應而達到防治AS的作用。

4參考文獻

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〔2013-12-06修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)