異甘草素對黃嘌呤氧化酶抑制的影響及機制

異甘草素對黃嘌呤氧化酶抑制的影響及機制

張瑞城鐘良寶梁海琴周桔豐

(海南醫學院附屬醫院腎內科，海南海口570102)

摘要〔〕目的探討異甘草素對黃嘌呤氧化酶(XO)的抑制作用機制。方法采用酶抑制動力學方法，研究異甘草素對XO的抑制作用和失活動力學，研究異甘草素對高尿酸小鼠尿酸(BUA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)含量及XO活性的影響。結果異甘草素對XO有良好的抑制作用〔半抑制濃度(IC50)為(19.32±2.23)μmol/L〕，失活動力學分析木犀草素能夠快速抑制XO的活性，此外異甘草素能夠明顯的降低高尿酸小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性(Pc<0.05，Pb<0.01)。結論異甘草素作為一種XO抑制劑，能夠快速誘導了XO活性的降低和BUA、Cr和BUN含量的降低，對調節患者尿酸水平起到重要作用，為臨床抗高尿酸血癥和痛風提供理論基礎。

關鍵詞〔〕異甘草素；黃嘌呤氧化酶；高尿酸小鼠；尿酸

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：海南省自然科學基金資助項目(20158333)

通訊作者：周桔豐(1979-)，女，營養師，主管護師，主要從事腎臟疾病營養與代謝研究。

第一作者：張瑞城(1976-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事慢性腎臟疾病基礎與臨床研究。

黃嘌呤氧化酶(XO)可以在機體內催化嘌呤類物質產生尿酸(BUA)，并伴隨著自由基的生成，當體內XO活性異常活躍時，嘌呤代謝而產生的BUA量增加，BUA在血液中最大飽和度為416.5 μmol/L，當濃度超過這個臨界值時，BUA在體內就會產生結晶〔1〕，出現急性的生理炎癥反應，從而引發高BUA血癥〔2〕，進而引起痛風的發作〔3〕。通過抑制XO的活性能夠抑制BUA的生成，并調整BUA在新陳代謝中的平衡，因此，XO抑制劑可以從根源上很好地控制、減輕高BUA血癥和痛風。異甘草素屬于黃酮類中的異黃酮類化合物，存在于豆科植物〔4～6〕中，具有較強的抗病毒、抗炎、抗血管生成、催眠等活性，其中，其降BUA作用是近年來研究的熱點。本課題研究異甘草素對XO的抑制作用和失活動力學，以期為異甘草素在降BUA治療領域更有效的應用提供理論參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑本實驗選用動物模型為ICR小鼠30只，質量為(20±2)g(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)；XO從牛乳中提取、氧嗪酸鉀鹽(Sigma公司)，其標準溶液用pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L)進行配制；黃嘌呤(Sigma公司)，異甘草素、別嘌呤醇(阿拉丁試劑有限公司)；緩沖體系為pH 7.5的磷酸鹽(50 mmol/L)。

UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；血BUA檢測試劑盒(北京普析通用儀器有限責任公司)；Millipore Simplicity水純化系統(法國密理博公司)；pHs-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；肌酐(Cr)、XO、 尿素氮(BUN)檢測試劑盒(阿拉丁試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1異甘草素對XO的抑制能力測定XO催化黃嘌呤產生BUA(在290 nm處有特征吸收峰)，參考文獻〔7〕的方法，在37℃下、XO(1×10-7mol/L)和不同濃度的異甘草素孵化3 h后，加入黃嘌呤，利用UV-2450紫外分光光度計的動力學/時間軟件，在290 nm處的吸光值每隔30 s測定1次，計算在含有不同異甘草素濃度的體系下XO的相對活性。

1.2.2異甘草素存在下，XO的失活動力學測定在37℃，相同的緩沖體系下，每隔3 min從不同濃度的異甘草素與XO孵化體系中取出相同體積的孵化液，加入底物，利用紫外-可見分光光度計的動力學/時間軟件測定XO失活的時間進程，并測定異甘草素存在下XO的失活速率。

1.2.3小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性測定除正常組外，其他組均給予腹腔注射氧嗪酸鉀鹽，作為高BUA血癥模型。在對小鼠注射氧嗪酸鉀鹽1 h后，從小鼠的眼眶后靜脈叢進行采血，25℃靜置1 h，之后3 500 r/min離心15 min，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測Cr、BUA和BUN含量；同時取小鼠肝臟的同一部位約100 mg，加入10 ml生理鹽水，并以8 000 r/min的速度勻漿20 min，使其組織充分勻漿化，之后將勻漿液以3 500 r/min的速度離心15 min，進行XO活性檢測。實驗均重復3次。

1.3統計學分析采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1異甘草素對XO的抑制作用隨著異甘草素(0～100 μmol/L)和別嘌呤醇(0～50 μmol/L)濃度的增加，XO的活性不斷降低；當異甘草素的濃度達到50 μmol/L時，其對XO的抑制能力趨于平緩，解析異甘草素和別嘌呤醇對XO的半數抑制濃度(IC50)為(19.32±2.23)μmol/L和(6.21±0.63)μmol/L。見圖1。

2.2XO的失活動力學研究在不同異甘草素濃度存在下，XO的相對活性隨著異甘草素孵化時間的增加并沒有發生變化。見圖2。

2.3異甘草素對小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性的影響模型組的BUA、Cr和BUN含量及XO活性明顯高于空白對照組(P<0.01)；陽性對照別嘌呤醇組的BUA、Cr和BUN含量及XO活性明顯低于模型組(P<0.01)；隨著異甘草素組濃度的增大，BUA、Cr和BUN含量及XO活性越來越明顯的低于模型組，在中劑量(25 μmol/L，P<0.05)和高劑量(75 μmol/L，P<0.01)時，BUA、Cr和BUN含量及XO活性明顯低于模型組。見表1。

圖1　異甘草素對XO活性的影響

圖2　異甘草素抑制XO的時間進程

組別XO活性(mmol/L)Cr(mmol/L)BUN(mmol/L)BUA(mmol/L)空白對照組48.56±3.1742.17±3.117.99±3.3857.23±2.35模型組62.21±1.321)138.32±6.121)20.12±2.631)152.11±5.311)別嘌呤醇組40.55±2.522)58.32±4.122)9.45±3.312)72.33±4.262)異甘草素組(5μmol/L)60.14±3.31129.23±4.3119.23±1.56137.22±4.28異甘草素組(25μmol/L)57.11±2.123)115.23±7.232)16.34±3.453)119.32±2.192)異甘草素組(75μmol/L)49.72±4.232)72.34±2.992)13.89±3.162)85.22±6.232)

與空白對照組相比:1)P<0.01，與模型組相比:2)P<0.01，3)P<0.05

3討論

目前是對高UA血癥和痛風的藥物治療可分為三種類型：一類是藥物通過降低或者減輕痛風帶來的炎癥反應來達到治療的目的。第二種是通過生物體內BUA排泄的增加，而達到降低血BUA的效果。第三種是能夠抑制BUA生成的藥物，即XO抑制劑〔8〕。目前臨床上用于抑制XO活性的抑制劑主要是別嘌呤醇，是一種競爭性嘌呤類似物抑制劑，也是次黃嘌呤的異構體，它能夠與酶活性中心的 Mo(Ⅳ)牢固結合，使 Mo(Ⅳ)不能輕易轉變為 Mo(Ⅵ)，進而抑制了BUA的生成〔9〕。但別嘌呤醇會引發毒副作用，因此，研究新的安全無副作用的XO抑制劑具有十分重要的意義。天然產物有效成分的XO的抑制劑來源廣泛，安全性高，引起了廣泛的關注。(1)食物來源的XO抑制劑，主要為生姜、山藥和蒜〔10〕，蜂膠〔11〕，玉米〔12〕；(2)中藥來源的XO抑制劑，主要為樗白皮〔13〕，卷柏屬種〔14〕，買麻藤〔15〕、丹參〔16〕、土連翹〔17〕，金銀花〔18〕。從以上抑制劑來源結果發現，黃酮類物質和酚酸類成分具有良好的XO抑制活性。且黃酮類化合物安全、有效，越來越成為治療痛風藥物開發的重點。然而，植物成分的藥理藥效不明，又制約了它的開發，因此，探討具有功能性因子的天然活性成分對XO抑制機制的研究是迫切需要的。本文研究表明，異甘草素能夠有效降低高BUA小鼠BUA、Cr和BUN含量及XO活性，此外，異甘草素對XO的抑制作用具有濃度依賴性，并能夠改變酶的生理結構和性質〔10〕。

抑制劑與酶的結合強弱、結合速度等直接關系到其對酶的抑制作用，藥物的治療效應以及藥物的副作用。本研究結果還發現異甘草素能夠輕松的與XO發生作用或者改變XO的構象，使酶的活性得到快速的抑制，且在短時間內失活，這意味著異甘草素能夠使XO的穩定態活力均快速下降，逐漸干擾底物與XO的結合，使尿酸含量在短時間內得以控制，及時緩解病人痛苦，值得臨床推廣。

4參考文獻

1中國醫師協會心血管內科醫師分會.無癥狀高尿酸血癥合并心血管疾病診治建議中國專家共識〔J〕.中國醫學前沿雜志,2010;2(3):49-55.

2鄭小微,夏道宗,張英,等.梅花總黃酮對黃嘌呤氧化酶的抑制作用及其抗氧化活性評價〔J〕.食品工業科技,2011;32(11):168-73.

3Perez-Ruiz F,Hernando I,Villar I,etal.Correction of allopurinol dosing should be based on clearance of creatinine,but not plasmacreatinine levels：another insight to allopurinol-related toxicity〔J〕.Clin Rheumatol,2005;11(3):129-33.

4Gong H,Zhang BK,Yan M,etal.A protective mechanism of licorice(Glycyrrhiza uralensis):isoliquiritigenin stimulates detoxification system via Nrf2 activation〔J〕.J Ethnopharmacol,2015;162(2):134-9.

5Zhao Z,Park SM,Guan L,etal.Isoliquiritigenin attenuates oxidative hepatic damage induced by carbon tetrachloride with or without buthionine sulfoximine〔J〕.Chem Biol Interact,2015;225(1):13-20.

6Takahama U,Koga Y,Hirota S,etal.Inhibition of xanthine oxidase activity by an oxathiolanone derivative of quercetin 〔J〕.Food Chem,2011;126(4):1808-11.

7Lin L,Dong Y,Zhao H,etal.Comparative evaluation of rosmarinic acid,methyl rosmarinate and pedalit isolated from Rabdosia serra(MAXIM)HARA as inhibitors of tyrosinase and α-glucosidase 〔J〕.Food Chem,2011;129(3):884-9.

8趙雪梅，譚昌恒，張輝.貓須草提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用〔J〕.中藥藥理與臨床,2009;25(3):45-7.

9趙瑩,張啟虹,馮明聲，等.降尿酸藥物黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進展〔J〕.藥學進展,2009;33(2):55-61.

10祁鑫,王昌祿,李風娟，等.常見蔬菜提取物對黃嘌呤氧化酶抑制作用的篩選研究〔J〕.現代食品科技,2011;27(5):511-4.

11吉積一真，賀玉琢.蜂膠降低黃嘌呤氧化酶活性及血漿尿酸值的作用〔J〕.國際中醫中藥志,2006;28(2):100-1.

12姜彤偉,徐建,王曉明，等.玉米須中抑制黃嘌呤氧化酶活性組分的篩選及其作用〔J〕.吉林大學學報·醫學版,2011;37(3):433-5.

13程富勝,胡庭俊,董鵬程,等.樗白皮提取物對小白鼠體內黃嘌呤氧化酶活性的影響〔J〕.中國獸醫科學,2006;36(8):665-7.

14黎莉,陳科力,牛田密，等.卷柏屬7種藥用植物的提取物抑制黃嘌呤氧化酶的活性研究〔J〕.中藥材,2007;30(4):445-7.

15楊琴芳,袁紅宇,錢雅璐，等.買麻藤提取物抑制黃嘌呤氧化酶活性實驗研究〔J〕.江蘇中醫藥,2009;41(12):77-8.

16尚雁君,黃才國,蔣三好，等.迷迭香酸對黃嘌呤氧化酶的抑制作用〔J〕.第二軍醫大學學報,2006;27(2):189-91.

17楊增明,楊樹娟.土連翹體外抑制黃嘌呤氧化酶活性研究〔J〕.中藥材,2010;33(6):964-7.

18李英,陳君,李萍.金銀花中酚酸類和黃酮類成分的黃嘌呤氧化酶抑制活性〔J〕.中國藥科大學報,2011;42(5):407-11.

〔2015-04-17修回〕

(編輯袁左鳴)