高效液相色譜法測定4種腫瘤細胞內2-甲氧基雌二醇含量

李銀英，劉　宇，張振中

(1. 鄭州大學第二附屬醫院西藥學部，河南 鄭州 450014；2. 鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001)

高效液相色譜法測定4種腫瘤細胞內2-甲氧基雌二醇含量

李銀英1，劉宇1，張振中2

(1. 鄭州大學第二附屬醫院西藥學部，河南 鄭州 450014；2. 鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001)

[摘要]目的建立腫瘤細胞內2-甲氧基雌二醇含量的測定方法，并測定不同時間、不同細胞系對2-甲氧基雌二醇的吸收情況。方法給予腫瘤細胞含有2-甲氧基雌二醇的培養基，固定時間點收集細胞，細胞破碎液進行液-液萃取，采用反相高效液相色譜法測定2-甲氧基雌二醇含量。結果所選擇的4種腫瘤細胞系最高吸收值均在2 h，不同細胞系對藥物的吸收量略有差別。結論該方法準確、操作簡單、靈敏度高，適合用于腫瘤細胞內2-甲氧基雌二醇含量的測定。

[關鍵詞]2-甲氧基雌二醇；腫瘤細胞；吸收；高效液相色譜法

2-甲氧基雌二醇是17β-雌二醇的內原性代謝產物，但其卻不與雌激素受體結合。近幾年研究[1]發現2-甲氧基雌二醇具有良好的抗腫瘤活性，能夠在無臨床毒副反應的劑量內抑制腫瘤細胞的生長，誘導腫瘤細胞的凋亡。另外，雖然2-甲氧基雌二醇已經進入到乳腺癌、前列腺癌等實體瘤的臨床Ⅰ、Ⅱ期研究，但臨床治療效果并不令人滿意，主要是因為其在靶部位或是血漿中不能持續維持有效濃度[2-4]。然而國內外對2-甲氧基雌二醇及其制劑的研究主要集中在抗腫瘤機制的研究[5]，尚未見有關其細胞藥物吸收，藥物含量方面的研究報道，因而我們針對該方面進行初步研究。

1材料與方法

1.1儀器AgilentlZoo/1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Agiteni熒光(美國Agilent公司)，AgilentlZoo化學工作站(美國Agilent公司)，MD200-2型氮氣吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)，JY92-11超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DJ-200J電子天平(ATAY公司)，AB135-S分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，分析柱phenomenex luna 5u C18(2)(250 nm×4.60 nm)等。

1.2藥品與試劑2-甲氧基雌二醇對照品(鄭州大學藥學院自制，純度99.1%，批號：20091105)，甲醇(天津四友精細化學品有限公司，色譜純)，其他試劑均符合常規標準。

1.3細胞系前列腺癌PC-3細胞系，肝癌HEPG-2細胞系，胃癌SGC-7901細胞系，乳腺癌細胞系MCF-7。

1.4試劑的配制2-甲氧基雌二醇標準溶液的配制：稱取1 mg 2-甲氧基雌二醇于10 mL容量瓶內，用甲醇：水(75:25)混合溶劑定容搖勻，即得100 μg·mL-1的2-甲氧基雌二醇儲備液，再用甲醇水(7525)的混合溶劑倍比稀釋成濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg·mL-1的系列標準溶液備用。

質控樣品2-甲氧基雌二醇溶液的配制：用標準曲線中高、中、低3種濃度中的每2個濃度等體積混合可得37.5、9.375、2.343 75 μg·mL-1的系列標準溶液。

細胞用2-甲氧基雌二醇溶液的配制：稱取2-甲氧基雌二醇，用DMSO溶解成10 mg·mL-1溶液，用于細胞時，用RPMI-1640培養基稀釋成4.5 μg·mL-1的所需濃度。

1.5方法

1.5.1細胞破碎液制備細胞用含有胎牛血清(體積分數10%)、雙抗(1%)的RPMI-1640培養基在37 ℃、含體積分數5% CO2的孵箱中培養，相同量傳代于培養瓶中，待細胞密度達70% ～ 80%時，實驗組加入含2-甲氧基雌二醇4.5 μg·mL-1的RPMI-1640培養基，分別于0.5、1、2、4、6 h定量收集細胞，并用PBS溶液洗滌2次，再用1 mL的PBS懸浮細胞使之成為1×106個/mL的細胞懸液，并轉移于5 mL EP管中；收集的細胞懸液用超聲波細胞粉碎機進行破碎(工作6 s，間歇8 s，200 W超聲25次)。

1.5.2樣品處理向細胞破碎液中加入提取試劑乙酸乙酯3 mL渦旋5 min；10 000 rpm離心10 min，取上層有機相于45 ℃下空氣吹開，殘留物于適量的甲醇：水(75:25)中渦旋溶解，10 000 rpm離心10 min后，吸取上層澄清液20 μL進樣測定。

1.5.3色譜條件色譜柱：phenomenex luna 5u C18(2)(250 nm×4.60 nm)；流動相：甲醇水(7525)；流速：0.75 μL·min-1；激發波長：288 nm，發射波長：325 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行統計學分析，所得計量數據采用計量資料用±s表示，2組間比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1專屬性在所選擇的色譜條件下，細胞代謝物等對2-甲氧基雌二醇的含量測定基本無干擾；2-甲氧基雌二醇的出峰時間約為9.4 min左右，分離效果見圖1。

圖1　2-甲氧基雌二醇色譜圖

2.2標準曲線和定量下限精密量取不同濃度的2-甲氧基雌二醇標準溶液各10 μL，45 ℃空氣揮盡溶媒，加入1 mL空白細胞破碎液，配制成15.625、31.25、62.5、125、250、500 ng·mL-1溶液，按前述方法進行處理，以2-甲氧基雌二醇峰面積對濃度進行線性回歸，得曲線的回歸方程為：A=1.230 1C-13.973(r2=0．999 1)表明在15.625～500 ng·mL-1范圍內線性良好，方法定量下限約是15 ng·mL-1。

2.3準確度與精密度精密量取不同濃度的2-甲氧基雌二醇標準溶液各10 μL，45 ℃空氣揮盡溶媒，加入細胞破碎液1 mL，準確配制低、中、高3個濃度分別為23..437 5、93.75、375 ng·mL-1的質量控制樣品各5份，連續配制、測定3 d，用以考查準確度、日內精密度及日間精密度。見表1。

表1　準確度與精密度

2.4提取回收率按照前述方法制備標準曲線及質量控制樣品；另取10 μL與質量控制樣品濃度相同的標準溶液用流動相，即甲醇水(7525)分別稀釋至1 mL。同法20 μL進樣測定。用質量控制測得的峰面積與未經提取的相同濃度溶液測得的峰面積作比，用以考查該方法的提取回收率。結果3種濃度下2-甲氧基雌二醇的提取回收率分別是(84.345 0±5.889 2)%、(88.147 0±2.368 7)%、(92.552 7±2.597 4)%。根據提取回收率70%是一般認為有較好的提取回收率，而80%～90%則被大多數人認為是一個可接受的限度[6]；可知本方法的提取回收率是可接受的。

2.5穩定性按前述方法制備3個濃度的質量控制樣品，吹干后密封于-20 ℃冰箱保存3 d，再復溶，20 μL進樣測定；進樣當天同法配制質量控制樣品，按前述方法配制標準曲線并同法測定。將2種質量控制樣品測定值進行比較。見表2。

表2　穩定性實驗結果

注：由于凍存質量控制樣品測定值在新配置質量控制樣品測定值5%范圍內認為有較好的穩定性[6]，提示該測定值符合要求

2.6方法學評價及藥物含量測定結果分析方法評價結果表明，該方法有較好的專屬性，準確度、精密度、提取回收率、穩定性均能達到分析要求，說明該方法用于細胞內2-甲氧基雌二醇含量測定是可行的。

采用該方法對4種不同細胞，不同時間藥物含量進行測定，實驗結果顯示，對4種不同腫瘤細胞加入同濃度2-甲氧基雌二醇原料藥，均在2 h時出現最大吸收，且總體上SGC-7901胃癌細胞吸收最好，其次依次為PC-3前列腺癌細胞、MCF-7乳腺癌細胞、HEPG肝癌細胞。見圖2。

圖2　不同腫瘤細胞系不同藥物作用時間2-甲氧基雌二醇含量

3討論

雖然國內外有文獻[7-9]建立了人體血漿中2-甲氧基雌二醇含量的測定方法，但是對細胞內2-甲氧基雌二醇的含量的測定還鮮有報道。在此我們建立了一種簡便、快速的測定細胞內2-甲氧基雌二醇含量的測定方法，該方法具有良好準確度、精密度及大多數人認可的提取回收率，并且有良好的穩定性。因而該方法可用于細胞內2-甲氧基雌二醇含量測定。并可以結合其他方法結合近一步說明2-甲氧基雌二醇及其制劑的作用機制。

參考文獻：

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[9]Lakhani NJ, Lepper ER, Sparreboom A, et al. Determination of 2-methoxyestradiol in human plasma, using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2005，19(9):1176-1182.

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.004

[中圖分類號]R979.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-5412(2015)05-0380-04

(收稿日期：2015-03-10)

High Performance Liquid Chromatography in the
Detection of 2-methoxyestradiol in Different Tumor Cell Lines

Li Yinying1,Liu Yu1,Zhang Zhenzhong2

(1.WesternMedicineDivision,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China;

2.DepartmentofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for determination the 2 - methoxyestradiol in cells, and to measure the absorption of 2-methoxyestradiol during different times, in different cell lines.MethodsThe medium containing 2-methoxyestradiol were given into cells, the cells were collected at fixed times, cell lysate was used to liquid-liquid extraction. Reversed-phase high performance liquid chromatography method was used to determine the contention of 2-methoxyestradiol.ResultsHighest absorption value of the four selected cell lines was 2 h, the drug uptake in different cell lines was slightly different.ConclusionThe method is accurate, simple operation, high sensitivity, suitable for the determination of 2-methoxyestradiol contention in tumor cell lines.

[Key words]2-methoxyestradiol; tumor cells; absorption; high performance liquid chromatography