桑細菌性萎蔫病及其病原的紅外光譜鑒別

羅金燕，楊春蘭，陳 磊，王 麗，毛勝鳳，李 斌

（1.上海市農業技術推廣服務中心,上海201103；2.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州310058；3.浙江農林大學 林業與生物技術學院 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

桑細菌性萎蔫病及其病原的紅外光譜鑒別

羅金燕1，楊春蘭2，陳 磊1，王 麗2，毛勝鳳3，李 斌2

（1.上海市農業技術推廣服務中心,上海201103；2.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州310058；3.浙江農林大學 林業與生物技術學院 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安 311300）

為快速有效鑒別桑細菌性萎蔫病，比較了桑細菌性萎蔫病菌Enterobacter mori和引起相似田間發病癥狀的桑青枯病菌Ralstonia solanacearum的紅外光譜。結果顯示：在4 000.00～500.00 cm-1范圍內，2種重要桑細菌病原存在5個共有峰，其中3個強度有顯著性差異。此外，桑萎蔫病菌的紅外光譜有1 399.10和1 079.45 cm-12個特征峰，桑青枯病菌的紅外光譜有2 973.49，1 724.42，1 380.60，1 278.67，1 185.12，1 132.03，1 100.51和979.31 cm-1等8個特征峰。進一步分析和比較感染桑萎蔫病的桑枝和健康桑枝的紅外光譜發現，感病枝和健康枝有5個相同的峰，其中4個強度有顯著差異；此外，感病枝有1到643.92和1 407.31 cm-12個特征峰，健康枝中有1 635.83，1 506.36，1 423.59，1 374.97，1 328.57和1 108.82 cm-16個特征峰。為利用傅里葉紅外光譜技術簡便、直觀和快速地鑒別桑細菌性萎蔫病及其病原提供了新的思路。圖2表3參19

植物保護學；桑樹;萎蔫病菌;青枯病菌;特征峰;傅里葉變換紅外光譜

桑樹Morus alba屬桑科Moraceae桑屬Morus，為落葉喬木，其葉片更是桑蠶Bombyx mori的主食，極具生態和經濟價值，廣泛分布于亞洲、非洲和歐洲［1-2］。然而，2004年以來，在浙江各地桑園陸續出現了一種國內外尚未報道過的桑樹新病害，持續時間長，發病面積廣，給農戶造成了重大的損失，嚴重威脅浙江省蠶桑產業的生產［2-3］。浙江大學生物技術研究所植物病原細菌實驗室前期研究表明：該病害由腸桿菌屬Enterobacter細菌引起，并將它命名為Enterobacter mori，將該病害定名為桑細菌性萎蔫病［4-6］。值得注意的是其田間癥狀與由Ralstonia solanacearum引起的桑細菌性青枯病相似，兩者同屬于桑樹細菌性維管束病害，不易區分［7-10］。傳統的細菌分類及鑒別方法主要是根據細菌的菌落形態、生理生化特征及血清學檢測等，雖然有效,但操作復雜,費時費力。以聚合酶鏈式反應（PCR）為基礎的各種現代分子生物學技術雖然極大地加快了細菌鑒定的效率，但嚴重依賴昂貴的儀器和試劑，且經常受到植物組織的干擾［11-12］。而傅里葉變換紅外光譜技術（FTIR）分辨率高,對樣品的需求量小，不僅能提供分子基團特征的振動吸收譜帶,而且能敏銳地探測分子基團及其周圍環境的變化，通過測定完整細胞的FTIR圖譜可獲得微生物細胞的組成及其生物大分子結構的信息［13-15］。近年來，FTIR圖譜中某些功能基因的差異已被用來區分和鑒定不同的微生物種甚至亞種［16-18］。本研究通過測定和比較桑萎蔫病菌和桑青枯病菌以及感染桑萎蔫病的枝條和健康枝條的紅外圖譜，并通過分離鑒定驗證了紅外光譜的檢測結果，提出了利用FTIR直接檢測桑細菌性萎蔫病的可行性。

1 材料與方法

1.1 桑細菌菌株

本研究中使用的桑細菌性萎蔫病菌菌株Enterobacter mori R18-2和桑細菌性青枯病菌菌株Ralstonia solanacearum ZJUM19981由浙江大學生物技術研究所植物細菌實驗室保存提供。

1.2 病原菌紅外檢測樣本制備

將保存在-70℃的桑細菌性萎蔫病菌菌株E.mori R18-2和桑細菌性青枯病菌菌株R.solanacearum ZJUM19981活化劃線于Luria-Bertani（LB）固體培養基和酵母膏胰蛋白胨葡萄糖瓊脂（YPGA）固體培養基，分別挑取單菌落接種于5.00 mL的LB液體培養基和YPGA液體培養基，在37℃和30℃條件下180 r· min-1培養24 h。在10 000 r·min-1條件下離心10 min，棄上清液，并用雙蒸水洗2次后低溫干燥，送樣。

1.3 桑枝條檢測樣本制備

離體桑枝注射接種方法參照徐麗慧等［9］。從桑園剪取長15 cm左右并頂部帶有3張桑葉的無病枝條，插入已滅菌的50.00 mL雙蒸水的三角瓶中，并用消毒棉花塞住瓶口來固定枝條。將比例為1011cfu ·L-1的E.mori R18-2菌懸液用滅菌的小號針筒針刺接種在離體枝條的近水基部，注射0.01至0.03 mL·枝條-1，重復3次，使用無菌水和標準桑青枯病菌作為對照。在人工氣候箱中（設定溫度為28℃，光照12 h·d-1，濕度100%）培養15 d，接種3 d后每天觀察病狀。取發病的桑枝和健康的桑枝，在-70℃液氮冰凍干燥條件下，置于研缽中用研杵研磨成粒徑小于2 μm的粉末，送樣。

1.4 FTIR檢測

將桑細菌或桑枝條于-70℃冰凍干燥后，置于研缽中，用研杵研磨成粒徑小于2 μm的粉末。按照m（復合材）∶m（溴化鉀）=1∶100的比例混合磨碎壓片8 min（100 kg·cm-2，1 200×0.006 895 MPa），將它們壓成薄片，用于紅外光譜測定（紅外光譜儀為美國熱電公司 Nicolet 5700；測試條件：光譜分辨率為4.00 cm-1，測量范圍4 000.00～500.00 cm-1，掃描信號累加100動平滑處理，自動基線校正，掃描時實時扣除水和二氧化碳的干擾，設不放入樣品的空背景作為背景，測1個樣品掃描背景1次）。重復5次·樣品-1，取波譜的平均值，用OMNIC 8.0軟件分析光譜數據［18-19］。

1.5 桑萎蔫病菌的分離與鑒定

用于FTIR檢測的20份桑枝條樣品，同時利用經典的植物病原細菌學研究方法開展桑萎蔫病菌的分離與鑒定，以驗證FTIR的檢測結果。桑萎蔫病菌的具體分離根據朱勃等［3］的方法進行，每份樣品挑取代表性菌株開展煙草Nicotiana tabacum過敏反應、Biolog生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等［3,11-12］。

1.6 統計分析

各處理間的顯著水平（P＜0.05）用統計分析軟件STATGRAPHICS Plus,版本 4.0（Copyright Manugistics Inc.,Rockville,Md.,USA）進行分析。

2 結果與分析

2.1 FTIR鑒別桑萎蔫和青枯病菌

由圖1和表1可知：在4 000.00～500.00 cm-1的光譜范圍之內，桑細菌性萎蔫病菌菌株R18-2和桑細菌性青枯病菌菌株ZJUM19981共有5個峰位相同，分別是1 237.25 cm-1（1 227.86 cm-1），1 453.67 cm-1，1 538.22 cm-1，1 650.74 cm-1和2 925.13 cm-1。其中1 237.25 cm-1（1 227.86 cm-1），1 453.67 cm-1和2 925.13 cm-1的峰強度差異顯著（P＜0.05）。吸收譜帶的歸屬如下：1 237.25 cm-1（1 227.86 cm-1）附近的吸收帶歸屬于核酸分子內磷酸二酯基團的反對稱P——O伸縮振動峰；1 453.67 cm-1歸屬于蛋白質分子中甲基的反對稱C—H彎曲振動峰；1 538.22 cm-1來自N—H的彎曲振動和C—N伸縮振動，主要來自于蛋白質酰胺Ⅱ；1 650.74 cm-1歸屬于C——O的伸縮振動，主要來自于蛋白質酰胺Ⅰ；2 925.13 cm-1來自蛋白質的C—H伸縮振動吸收帶［14-17］。

圖1 桑青枯病菌ZJUM19981（a）和桑萎蔫病菌R18-2（b）在4 000.00～500.00 cm-1波段范圍的紅外光譜圖Figure 1 FTIR spectra in 4 000.00-500.00 cm-1（a）Enterobacter mori R18-2 and（b）Ralstonia solanacearum ZJUM19981

桑細菌性萎蔫病菌菌株 R18-2有1 399.10 cm-1和1 079.45 cm-1這2個特有的峰位，分別屬于COO—的對稱伸縮振動和來自于磷脂的C—O伸縮振動。桑青枯病菌菌株ZJUM19981有2 973.49 cm-1，1 724.42 cm-1，1 380.60 cm-1，1 278.67 cm-1，1 185.12 cm-1，1 132.03 cm-1，1 100.51 cm-1和979.31 cm-1等8個特有的峰位。這些主要吸收譜帶的歸屬如下：2 973.49 cm-1的譜峰來自脂類的C—H伸縮振動吸收帶，反映脂肪酸、各種膜和細胞壁組分的親水脂分子的信息；1 724.42 cm-1歸屬于C——O的伸縮振動，主要來自于甘油三酯；1 380.60 cm-1歸屬于C—H的彎曲振動，1 278.67 cm-1歸屬于C—O的伸縮振動，主要來自于芳香族的甲氧基；1 185.12 cm-1處的吸收譜帶主要來自于細胞壁的主要成分碳水化合物中多聚糖中的C—O（H）伸縮振動；1 132.03 cm-1歸屬于C—O伸縮振動，主要來自于DNA和RNA骨架，糖原和核酸等；1 100.51 cm-1歸屬于C—O的伸縮振動；979.31 cm-1歸屬于磷酸化蛋白和核酸中磷酸單酯二價陰離子-PO42-基團的對稱伸縮振動［14-15］。

表1 桑萎蔫病菌菌株R18-2與桑青枯病菌菌株ZJUM19981的紅外光譜主要吸收峰比較Table 1 Comparison of FTIR spectra between Enterobacter mori R18-2 and Ralstonia solanacearum ZJUM19981

2.2 FTIR鑒別健康和感病桑枝條

圖2 感染桑細菌性萎蔫病的桑枝（a）和健康桑枝（b）和在4 000.00～500.00 cm-1波段范圍的紅外光譜圖Figure 2 FTIR spectra in 4 000.00-500.00 cm-1（a）the healthy mulberry branches and （b）the mulberry branches infected with Enterobacter mori R18-2

由圖2和表2可知：在4 000.00～500.00 cm-1范圍內，感染桑細菌性萎蔫病的桑枝和健康桑枝有5個相同峰位，分別是2 927.05 cm-1（2 928.84 cm-1），1 732.63 cm-1（1 735.81 cm-1），1 248.00 cm-1（1 246.82 cm-1），1 160.17 cm-1（1 159.15 cm-1）和1 053.70 cm-1（1 054.66 cm-1），除1 160.17 cm-1（1 159.15 cm-1）外，其他4個峰在強度上差異顯著。這表明：桑組織內的木質素、纖維素和半纖維素等已被桑萎蔫病菌選擇性的消耗。吸收譜帶歸屬如下：2 927.05 cm-1（2 928.84 cm-1）歸屬于C—H的伸縮振動，主要來自于脂類，少量來自于蛋白、碳水化合物和核酸；1 732.63 cm-1（1 735.81 cm-1）主要來自于木聚糖（半纖維素）中的非共軛C—O伸縮振動；1 248.00 cm-1（1 246.82 cm-1）主要來自于木質素和木聚糖中的C—O伸縮振動和紫丁香基環；1 160.17 cm-1（1 159.15 cm-1）主要來自于纖維素和半纖維素中的C—O—C振動；1 053.70 cm-1（1 054.66 cm-1）主要來自于纖維素和半纖維素中的C—O振動［14-16］。

桑健康枝中有1 635.83，1 506.36，1 423.59，1 374.97，1 328.57和1 108.82 cm-1等6個特征峰。由于桑是雙子葉硬木植物，其木質素主要含愈創木基-紫丁香基木質素（G-S），這個結果顯示健康桑枝的紅外吸收光譜圖與其他的木質素光譜圖相似。在1 635.83 cm-1和1 506.36 cm-1處，有明顯的芳香核振動峰，這是木質素最具特征的紅外吸收帶。此外，1 423.59 cm-1主要來自于木質素和糖類的C—H振動；1 374.97 cm-1主要來自于纖維素和半纖維素中的C—H振動；1 328.57 cm-1主要來自于纖維素中的C—H的彎曲振動和紫丁香基丙烷衍生物中的C1—O的伸縮振動；1 108.82 cm-1主要來自于紫丁香核C—H面內彎曲振動［14-17］。此外，被細菌性萎蔫病感染的病桑紅外光譜圖中具有 1 643.92 cm-1和1 407.31 cm-1這2處特征峰，分別屬于蛋白質酰胺Ⅰ中的C—O伸縮振動和COO—的對稱伸縮振動。在光譜分辨率為4.00 cm-1條件下，1 407.31 cm-1與萎蔫病菌紅外圖譜中的1 399.10 cm-1屬于同一特征峰，可作為檢測桑細菌性萎蔫病的依據。相對于桑健康枝，感病枝中缺乏1 635.83，1 506.36，1 423.59，1 374.97，1 328.57和1 108.82 cm-1等6個特征峰。1 506.36 cm-1處木質素特征峰的消失和1 643.92 cm-1處特征峰出現，顯示了相對于糖類而言，萎蔫病菌更偏好降解消耗木質素，這也解釋了萎蔫病菌大量定殖于植物根莖維管束組織，堵塞導管，引起葉片和植株上層水分的缺乏，造成萎蔫癥狀的原因之一，與王國芬等［2］的桑萎蔫病標記菌株R18-gfp-1實驗結果相一致。由于發病組織和健康組織的結構組分存在一定程度上的差異，通過對比兩者的傅立葉紅外光譜圖的峰型、峰位、峰高等，為快速鑒別桑萎蔫病提供了更加簡便、直觀、快速的技術手段。

表2 桑細菌性萎蔫病菌菌株R18-2接種發病桑枝和健康桑枝的紅外光譜主要吸收峰比較Table 2 Comparison of FTIR spectra between the mulberry branches infected with and without Enterobacter mori R18-2

2.3 FTIR檢測的分離驗證

FTIR檢測為健康的10份桑枝條上分離到的細菌均無煙草過敏反應，挑取代表性菌株進行16S rDNA測定與分析，證實都不是桑萎蔫病菌。FTIR檢測為疑似桑桑萎蔫病菌感染的10份桑枝條，除1份樣品未分離到煙草過敏反應陽性的菌株外，其他9份樣品的代表性菌株煙草過敏反應呈陽性。經過Biolog鑒定，與桑萎蔫病菌相似度為0.61～0.76；16S rDNA序列相似度為97%～98%，證實了這些樣品都有桑萎蔫病菌的感染。

3 結論與討論

桑細菌性萎蔫病作為近年來浙江乃至全國新出現的一種桑樹新病害，目前對其病害的流行規律，傳播途徑以及病原菌的致病機制都研究甚少，給中國的蠶桑產業帶了很大的潛在風險。特別值得重視的是，從浙江省臨安市、桐廬縣等地桑樹的田間發病情況以及我們的室內離體桑枝注射接種實驗來看，由桑萎蔫病菌引起的病桑外部表現與桑細菌性青枯病大致相似：老葉枯黃、新葉萎蔫，直至全株枯萎，植株長勢衰弱；解剖發病植株根莖維管束，可觀察到植株莖干木質部褐變［10］。相似的發病癥狀使得桑細菌性萎蔫病在田間常被誤診為桑細菌性青枯病，導致了錯誤的防治對策。

表3 桑細菌性萎蔫病紅外光譜檢測的分離驗證Table 3 Confirm of FTIR spectra detection based on the isolation and identification of Enterobacter mori

早期的診斷與檢測無疑是有效預防植物病害發生與危害的有效方法，然而，由于傳統的植物病原細菌的分離鑒定不僅需要有一定的經驗和技術，也需要較長的時間，特別是由于桑樹作為一種木本植物，病原細菌的分離和致病性檢測都不易進行，周期更是比一般草本植物長，使得難以快速、準確地早期檢測診斷桑細菌性萎蔫病的發生。而紅外光譜技術能夠克服傳統植物病害診斷與檢測方法的各種弊端，加上具有操作簡單，診斷時間短的優點，對植物細菌病害的檢測與診斷將是一個極好的補充。

本研究顯示桑萎蔫病菌和桑青枯病菌這2種桑樹重要病原細菌有不同的紅外吸收光譜，5個共同峰中的3個在峰強度上有顯著差異，桑萎蔫病菌和桑青枯病菌分別有2個和8個特征峰，特別是桑萎蔫病菌具有1 399.10 cm-1和1 079.45 cm-1這2個特有的峰位，為利用FTIR快速鑒定引起桑樹相似病害的桑萎蔫病菌和桑青枯病菌提供了依據。同時發現萎蔫病菌感染的桑枝條和健康枝條也有不同的紅外光譜圖譜，5個共同峰中的4個在峰強度上有顯著差異，特別是萎蔫病菌感染的桑病枝具有1 643.92 cm-1和1 407.31 cm-1這2個特征峰，為利用紅外光譜技術直接無損傷鑒別桑樹是否感染萎蔫病提供了可能。

FTIR檢測為健康的10份桑枝條上分離到的代表性菌株經過鑒定，證實都不是桑萎蔫病菌，FTIR檢測為疑似桑萎蔫感染的10份桑枝條有9份的代表性菌株經過煙草過敏反應、Biolog鑒定和16S rDNA序列分析鑒定為桑萎蔫病菌，證實了這些樣品應該都有桑萎蔫病菌的感染，其中1份紅外檢測為萎蔫病菌感染的樣品沒有分離到桑萎蔫病菌。這一方面可能是由于病菌剛開始感染，數量較少，加上是木本植物樣品，造成難以分離到；另一方面，由于本實驗涉及到的主要是桑病原細菌，在實際操作過程中，還要考慮桑枝條上可能有和桑萎蔫病菌相似紅外成份的環境細菌的干擾，造成紅外檢測的假陽性。

本研究利用紅外光譜技術比較了能引起桑樹相似病癥的桑萎蔫病菌和桑青枯病菌，以及萎蔫病菌感染的桑枝條和健康枝條的紅外光譜圖譜，發現它們在峰型、峰的數量、峰位及特定峰的吸收強度上都存在較大差別，同時通過分離鑒定的方法對紅外檢測的桑枝條進行了驗證，整體上發現利用這些傅里葉紅外光譜上的特征峰可以作為萎蔫病菌的生物標記，用于快速鑒別桑細菌性萎蔫病。但桑樹上可能有相似紅外圖譜的環境微生物，需要增加更多樣品測試來選取更加特異的峰作為標記，避免其他微生物的干擾。

4 致謝

感謝浙江大學植物保護系田文效先生在紅外光譜樣品準備中的幫助。

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Detection and identification of mulberry bacterial wilt and its pathogen using Fourier transform infrared spectra

LUO Jinyan1,YANG Chunlan2,CHEN Lei1,WANG Li2,MAO Shengfeng3,LI Bin2
（1.Shanghai Extension and Service Center of Agriculture Technique,Shanghai 201103,China;2.Agricultural and Biotechnological College,Zhejiang University,Hangzhou 310058,Zhejiang,China;3.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A&F University, Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To rapidly identify a newly emerging mulberry wilt disease in Zhejiang Province,this study compared Fourier transform infrared （FTIR）spectra of Enterobacter mori and Ralstonia solanacearum,which cause similar disease symptoms on mulberry.First,FTIR spectra were taken on E.mori and R.solanacearum,and then a comparison of mulberry branches infected with and without E.mori was performed based on FTIR spectra.Results for E.mori and R.solanacearum in the 4 000.00-500.00 cm-1region showed 5 similar peaks with 3 of the similar peaks differing in intensity.Peaks at 1 399.10 and 1 079.45 were specific to E.mori; whereas,peaks at 2 973.49,1 724.42,1 380.60,1 278.67,1 185.12,1 132.03,1 100.51,and 979.31 cm-1were specific to R.solanacearum.The FTIR spectra for healthy and infected mulberry branches showed 5 similar peaks in the 4 000.00-500.00 cm-1region with 4 of the similar peaks differing in intensity.Peaks at 1 643.92 and 1 407.31 cm-1were specific to infected branches;whereas,peaks at 1 635.83,1 506.36, 1 423.59,1 374.97,1 328.57,and 1 108.82 cm-1were specific to healthy branches.This study indicated thatFourier transform infrared spectra could provide a simple,intuitive,and fast technology for rapid detection and identification of mulberry bacterial wilt.［Ch,2 fig.3 tab.19 ref.］

plant protection;mulberry;Enterobacter mori;Ralstonia solanacearum;specific weak;FTIR

S763.1；S888.71

A

2095-0756（2015）04-0578-07

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.04.013

2014-10-16；

2014-12-01

上海市農業基礎性研究項目［滬農科基字（2014）第2-7號］；國家自然科學基金資助項目（31371904）；浙江省自然科學基金資助項目（R13C140001，LY14C140005）；浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2014C32010）作者簡介：羅金燕，從事植物檢疫研究。E-mail：toyanzi@126.com。通信作者：李斌，副教授，博士，博士生導師，從事植物細菌學研究。E-mail：libin0571@zju.edu.cn