鏈霉菌Js-1T發酵條件及其對疣孢霉病的防治效果研究

鏈霉菌Js-1T發酵條件及其對疣孢霉病的防治效果研究

李兵兵1，2，溫志強1*

(1.福建農林大學，福建福州 350002；2.江蘇省淮安市疾病預防控制中心，江蘇淮安 223001)

摘要[目的]探討鏈霉菌Js-1T的發酵條件及防治效果。[方法]通過單因素試驗優化鏈霉菌菌株Js-1T防治疣孢霉病的發酵培養基和條件，測定其發酵液對疣孢霉菌(Mycogone perniciosa)的田間防治效果。[結果] Js-1T菌株的最佳培養基配方為：甘露糖30.0 g，KNO3 2.0 g，MgSO4 1.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳發酵條件為：30 ℃，pH=8，250 ml三角瓶裝液量為100 ml。發酵液對疣孢霉菌的田間防治效果顯著，對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的疣孢霉病的防治效果分別達68.77%、83.84%、85.62%。[結論]鏈霉菌Js-1T在疣孢霉病防治上具有很好的應用前景。

關鍵詞鏈霉菌Js-1T；發酵優化；疣孢霉菌；生物防治

中圖分類號S436.46

基金項目國家支撐計劃項目(2013BAD16B03)。

作者簡介李兵兵(1986- )，男，江蘇淮安人，碩士，從事應用微生物學與基因工程研究。*

收稿日期2015-08-03

Optimization on Fermentation Conditions ofStreptomycesJs-1Tand Inhibition of the Fermented Liquid againstMycogoneperniciosa

LI Bing-bing1,2, WEN Zhi-qiang1*(1. Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou, Fujian 350002; 2. Huai’an Center for Disease Control and Prevention，Huai’an, Jiangsu 223001)

Abstract[Objective] The aim was to study fermentation conditions and control effect of Streptomyces Js-1T. [Method] In order to increase the productivity of activities substance of strain Js-1T, the composition of fermenting solution and fermenting conditions were optimized by single factor. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa was also tested. [Result] The optimum fermenting solution were Mannose 30.0 g, KNO3 2.0 g, MgSO4 1.5 g, K2HPO4 1.0 g, NaCl 0.1 g, and water 1 000 ml; the optimal fermenting conditions were temperature 30 ℃, pH=8, and 100 ml liquid medium in 250 ml flake. The inhibition of its fermented liquid against Mycogone perniciosa Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were 68.77%, 83.84% and 85.62%, respectively. [Conclusion] Streptomyces strain Js-1T had certain application prospect in control of Mycogone perniciosa.

Key wordsStreptomycesstrain Js-1T; Fermenting optimization;Mycogoneperniciosa; Biological control

雙孢蘑菇疣孢霉病是由疣孢霉菌侵染引起的一種世界性病害[1-2]，近年來我國雙孢蘑菇疣孢霉病發生日趨嚴重，已成為制約我國雙孢蘑菇生產發展的重要因素之一[3]。目前，疣孢霉病主要使用化學藥劑來防治，但化學藥劑容易造成農藥殘留和環境污染。目前利用生物防治控制疣孢霉病的研究較少，蔡少芬等[4]分離到一株對疣孢霉菌有抑制作用的枯草芽孢桿菌，王勇等[5]研究發現裂褶菌發酵液對疣孢霉菌絲生長的抑制率達48.96%。Js-1T菌株是從銀耳栽培料中分離得到的一株鏈霉菌，初步研究發現該菌株對疣孢霉菌具有很強的抑制作用。筆者對Js-1T菌株的發酵培養基和條件進行了初步優化，并測定了發酵液對疣孢霉菌的防治效果，以期為Js-1T菌株的進一步開發利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。鏈霉菌Js-1T菌株，從銀耳楊梅霜病發病菌筒分離獲得并保存于中國典型培養物保藏中心(保藏號：CCTCCM2011365)。疣孢霉菌、雙孢蘑菇2796菌株均由福建農林大學菌物研究中心提供。

1.1.2培養基。葡萄糖馬鈴薯培養基(PDA)：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 ml，pH自然。Bennett培養基：葡萄糖10.0 g，酵母浸膏1.0 g，牛肉浸膏1.0 g，酶水解酪素2.0 g，水1 000 ml。發酵基礎培養基：碳源25.0 g，氮源3.0 g，MgSO41.5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml，pH 7。

1.2方法

1.2.1菌株活化。將Js-1T菌株接種于液體Bennett培養基中，在轉速為160 r/min、溫度為30 ℃的恒溫搖床中培養4 d。吸取50 μl培養好的液體菌種涂布于PDA平板上，30 ℃培養7 d，供試驗用。

1.2.2發酵液活性測定。以疣孢霉菌作為指示菌，采用生長速率法[5-6]測定發酵液的活性。用直徑為0.22 μm的一次性細菌過濾器過濾發酵液，取13 ml上述無菌發酵液添加到100 ml溫度為40 ℃左右的固體PDA中，充分混合均勻后倒平板。待培養基凝固后，接種直徑為1 cm的疣孢霉菌菌餅，每個處理5次重復。同時，以添加13 ml無菌水的培養基作為對照。25 ℃下培養，待空白對照接近長滿培養皿時，測量菌落半徑，并計算抑菌率。

抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-原菌餅直徑)×100%[7]

1.2.3種子培養液的制備。用無菌接種環挑取Js-1T菌株的孢子接到裝有100 ml發酵基礎培養基的250 ml三角瓶中，160 r/min、30 ℃培養4 d。

1.2.4碳源篩選。在發酵基礎培養基中分別添加2%(W/V)的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘油作為唯一碳源，按6 ml/100 ml接種量接種種子發酵液，30 ℃培養14 d。按照“1.2.2”方法測定發酵液的抑菌活性。

1.2.5氮源篩選。在發酵基礎培養基中分別添加0.3%(W/V)的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、酵母提取物作為唯一氮源，按6 ml/100 ml接種量接種種子發酵液，30 ℃培養14 d。按照“1.2.2”方法測定發酵液的抑菌活性。

1.2.6碳源添加量試驗。將“1.2.4”篩選出的碳源按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%(W/V)添加量加入培養基，按6 ml/100 ml接種量接種種子發酵液，30 ℃培養14 d。篩選出最適碳源添加量。

1.2.7氮源添加量試驗。將“1.2.5”篩選出的氮源按0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.6%(W/V)添加量加入培養基，按6 ml/100 ml接種量接種種子發酵液，30 ℃培養14 d。篩選出最適氮源添加量。

1.2.8溫度對發酵液活性的影響試驗。以篩選出的碳源、氮源按照最適添加量配制培養基，按100 ml/250 ml裝液量接種6 ml種子發酵液，分別測定20、25、28、30、35 ℃條件下發酵液的抑菌活性。

1.2.9初始pH對發酵液活性的影響試驗。將最適培養基的pH分別調節至5、6、7、8、9，接種6 ml種子發酵液，30 ℃恒溫培養14 d。培養結束后將發酵液的pH調至中性，測定發酵液的活性。

1.2.10裝液量對發酵液活性的影響試驗。分別將50、100、150、200 ml的培養基裝入250 ml三角瓶中。按選出的最佳接種量接入種子發酵液，30 ℃恒溫培養14 d。測定發酵液的活性。

1.2.11發酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治試驗。分別用3個類群疣孢霉菌的孢子懸液感染雙孢蘑菇覆土，然后用Js-1T菌株發酵液處理覆土，每個處理設置20 m2的出菇面積，10 d后按5點取樣法統計新長出雙孢蘑菇子實體的病菇和健菇的數目，計算發病率和防治效果。

2結果與分析

2.1碳源篩選由圖1可知，甘油作為碳源時，發酵液對疣孢霉抑制作用最低(2.01%)；甘露糖作為碳源時，發酵液抑菌活性最高(23.43%)；其余依次為麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖。

圖1　不同碳源對發酵液抑菌活性的影響

2.2氮源篩選由圖2可見，在供篩選的4種氮源中，(NH4)2SO4、KNO32種無機氮源比有機氮源酵母提取物和蛋白胨抑菌效果好，氮源為KNO3時Js-1T菌株發酵液的抑菌活性最強，抑菌率為15.20%。

圖2　不同氮源對發酵液抑菌活性的影響

2.3碳源添加量碳源添加量對發酵液的抑菌活性有顯著影響(圖3)，添加量在10～30 g/L時，隨著添加量的增加，發酵液抑菌活性逐漸增強，添加量為30 g/L時發酵液抑菌活性達到最高(17.64%)。繼續添加甘露糖，發酵液抑菌活性開始下降。

圖3　甘露糖添加量對發酵液抑菌活性的影響

2.4氮源添加量根據“2.2”試驗結果選擇KNO3作為氮源，添加量為2.0 g/L時，發酵液對疣孢霉抑菌效果最佳，抑菌率為20.76%(圖4)，之后隨添加量的增加，發酵液的抑菌活性開始降低。

圖4　KNO 3添加量對發酵液抑菌活性的影響

2.5溫度對Js-1T菌株發酵液抑菌活性的影響由圖5可知，30 ℃為Js-1T菌株發酵產生活性物質的最佳溫度，此時發酵液的抑菌活性為26.28%。

圖5　溫度對發酵液抑菌活性的影響

2.6初始pH對Js-1T菌株發酵液抑菌活性的影響初始pH對Js-1T菌株發酵液的抑菌活性有顯著影響。在酸性和強堿環境中發酵液的抑菌活性較低，初始pH為8時發酵液的抑菌活性最強，但當發酵液初始pH等于9時，發酵液對疣孢霉幾乎沒有抑制作用(圖6)。

圖6　初始pH對發酵液抑菌活性的影響

2.7裝液量對Js-1T菌株發酵液抑菌活性的影響在250 ml三角瓶中裝100 ml發酵液時，對疣孢霉菌的抑制活性最強，再增加裝液量，抑菌活性則降低(圖7)，說明Js-1T菌株發酵時對氧氣需求較高。因此，Js-1T菌株發酵時的裝液量選擇100 ml/250 ml。

圖7　裝液量對發酵液抑菌活性的影響

2.8發酵液對3個類群疣孢霉菌的田間防治效果由表1可知，Js-1T菌株發酵液使雙孢蘑菇的疣孢霉病發病率明顯降低。其中，對疣孢霉Ⅰ類引起的栽培中雙孢蘑菇2796的防治效果相對較低，為68.77%，對Ⅱ類和Ⅲ類疣孢霉病的防治效果較高，分別達83.84%、85.62%。由此可見，Js-1T菌株發酵液在孢霉菌的防治方面具有很好的應用價值。

3結論與討論

通過單因素篩選初步確定了Js-1T菌株發酵的最佳培養基配方為：甘露糖30.0 g，KNO32.0 g，MgSO41.5 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.1 g，水1 000 ml；最佳發酵條件為：溫度30 ℃，pH=8，250 ml三角瓶中裝100 ml發酵液。田間防治試驗結果表明，Js-1T菌株發酵液對Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類3個類群疣孢霉菌引起的栽培中雙孢蘑菇2796的疣孢霉病的防治效果顯著，防治效果分別達68.77%、83.84%、85.62%。發酵是一個十分復雜的過程，許多因素會影響到最終試驗結果[6-7]。該研究通過單因素試驗方法確定了Js-1T菌株的最佳發酵條件，提高了Js-1T菌株代謝產生拮抗物質的能力，但是還需通過正交或響應面法進一步優化發酵條件。

表1　Js-1 T菌株發酵液對3類疣孢霉菌引起雙孢蘑菇病害的防治效果

自1943年Waksman首先發現鏈霉菌可以產生鏈霉素以來，放線菌已經成為公認的新抗生素產生菌的主要來源[8]。目前已經發現的抗生素有80%以上是由放線菌產生的，其中又以鏈霉菌屬的菌株產生的最多[9]。農用抗生素作為抗生素的一類，具有活性高、對使用環境的污染少、在環境中不易積累、來源廣、可再生等優點[10]，在農業生產中有很好的應用前景。Js-1T菌株是從銀耳發病菌筒中分離到的鏈霉菌，并且福建農林大學菌物研究中心已經利用多相分類鑒定該菌株為鏈霉菌屬的一個新種，因此，該菌株產生新的抑菌活性物質的可能性較高。從Js-1T菌株發酵液中提取、鑒定有效活性物是下一步研究的重點。此外，利用鏈霉菌防治疣孢霉病的研究目前尚未見報道，該試驗結果對后續發酵中試放大、有效活性物質的分離純化以及疣孢霉病的防治具有重要意義。

參考文獻

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