連夏配方顆粒對心梗后大鼠心肌組織酪氨酸羥化酶mRNA、乙酰膽堿酯酶mRNA表達的影響

·論著·

作者單位：100029 北京中醫藥大學[李家立(博士研究生)、田辰、郝騰、馬娜娜(碩士研究生)]；北京中醫藥大學第三附屬醫院心內科(李平、白芳芳、劉衛寧)，重癥監護室(馬洪皓)

連夏配方顆粒對心梗后大鼠心肌組織酪氨酸羥化酶mRNA、乙酰膽堿酯酶mRNA表達的影響

李家立李平馬洪皓田辰郝騰白芳芳劉衛寧馬娜娜

【摘要】目的觀察連夏配方顆粒對心肌梗死后大鼠心梗周圍區心肌組織酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)mRNA與乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)mRNA表達的影響。方法將90只健康雄性成年Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、美托洛爾組、連夏配方顆粒189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg組；假手術組只穿線，不結扎左冠狀動脈前降支，余各組均結扎左冠狀動脈前降支以建立急性心肌梗死大鼠模型；假手術與模型組大鼠予生理鹽水灌胃，余各組均予相應實驗藥物；連續給藥30天后，采用Real-time RT-PCR方法檢測心梗周圍區心肌TH mRNA與AchE mRNA表達水平。結果與假手術組比較，模型組大鼠心梗周圍區心肌組織TH mRNA與AchE mRNA表達均明顯增高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，連夏配方顆粒189.00、94.50、47.25 mg/kg組大鼠心梗周圍區TH mRNA與AchE mRNA表達均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與美托洛爾組比較，連夏配方顆粒189.00 mg/kg組大鼠心梗周圍區TH mRNA與AchE mRNA表達均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。結論連夏配方顆粒可顯著降低心肌梗死后大鼠心梗周圍區心肌組織TH mRNA與AchE mRNA的表達，達到改善心肌梗死后大鼠心梗周圍區自主神經重構的作用。

【關鍵詞】連夏配方顆粒；心肌梗死；自主神經重構；酪氨酸羥化酶；乙酰膽堿酯酶

基金項目：國家科技支撐計劃(2007BAI10B02-07)；北京中醫藥大學自主選題(2013-ZYLC-015)；北京中醫藥大學自主選題(2013-JYBZZ-XS-170)

作者簡介：李家立(1985- )，2012級在讀博士研究生。研究方向：中醫藥防治心血管系統疾病。E-mail：lijiali5678@163.com

通訊作者：李平(1965- )，女，博士，主任醫師，博士生導師。研究方向：中醫藥防治心血管系統疾病。E-mail：pearll2008@126.com

【中圖分類號】R285.5

收稿日期：(2015-01-02)

Effects ofLianXiaFormula Granule on TH mRNA and AchE mRNA expression level in rats after myocardial infarctionLIJia-li，LIPing，MAHong-hao，etal.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor:LIPing，E-mail：pearll2008@126.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of LianXia Formula Granule(LXFG) on TH mRNA and AchE mRNA expression level at infarcted border zone of rats after myocardial infarction(MI). MethodsNinty healthy adult male Wistar rats were randomly assigned to six groups:sham operated group，model group，metoprolol group，189.00 mg/kg-dose of LXFG group，94.50 mg/kg-dose of LXFG group、47.25 mg/kg-dose of LXFG group.The sham operated rats were not ligated in the left anterior descending coronary artery except the rest groups.The sham operated group and model group were given with normal saline by intragastric administration,and the rest groups were given with medicine for testing by intragastric administration.Thirty days later, TH mRNA and AchE mRNA expression level were separately measured in all groups. ResultsCompared with the model group, TH mRNA and AchE mRNA expression level in the 189.00，94.50，47.25 mg/kg-dose of LXFG group decreased(P<0.05 or P<0.01).Compared with the metoprolol group,TH mRNA and AchE mRNA expression level in the 189.00 mg/kg-dose of LXFG group decreased(P<0.05 or P<0.01). ConclusionApplication of LianXia Formula Granule in rats after MI can significantly decrease the expression level of TH mRNA and AchE mRNA to improve cardiac autonomic neural remodeling.

【Key words】LianXiaFormula Granule；Myocardial Infarction；Cardiac Autonomic Neural Remodeling；Tyrosine hydroxylase；Acetylcholinesterase

在急性心肌梗死幸存的慢性人群中，仍有50%以上患者會死于致命性室性心律失常[1]。研究證實，心肌梗死發生后，在伴隨心肌發生缺血、損傷、壞死和重構的同時，相同及周圍區域的包括心交感神經與心迷走神經在內的心臟自主神經，也隨之發生一定程度的損傷、壞死和重構，并在人體致命性心律失常的發生過程中起關鍵性作用[2-4]。而心肌梗死周圍區則是心梗后組織修復、神經再生的敏感地帶，較梗死區和非梗死區更加明顯[5-6]。

本研究通過復制心肌梗死大鼠模型，連續灌胃給予實驗藥物，旨在觀察中藥小復方連夏配方顆粒對心肌梗死后大鼠心梗周圍區酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)mRNA與乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)mRNA表達的影響，探討連夏配方顆粒對心肌梗死后大鼠心梗周圍區自主神經重構的干預作用。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性清潔級42～49日齡Wistar大鼠90只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0007。

1.2主要藥品與試劑

連夏配方顆粒由黃連、姜半夏中藥免煎顆粒混合組成，均購買于北京中醫藥大學第三附屬醫院，均由北京康仁堂藥業有限公司生產并提供質檢報告。根據連夏配方顆粒原方比例(黃連∶姜半夏=1∶1)、黃連與姜半夏的煎煮濃縮工藝及人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表法計算得到：大鼠連夏配方顆粒等效劑量為94.50 mg/kg，作為本研究連夏配方顆粒中劑量組大鼠每天灌胃劑量；以中劑量的2倍，即189.00 mg/kg作為高劑量；以中劑量的0.5倍，即47.25 mg/kg作為低劑量。酒石酸美托洛爾片，生產批號：1103070C，阿斯利康制藥有限公司。超純RNA提取試劑盒(Cat#CW0581)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(Cat#CW0744)、UltraSYBR Mixture(With ROX)(Cat#CW0956)、DNase 1(Cat#CW2090)、5xRNA Loading Buffe(Cat#CW0611A)等均購自CWbio.Co.Ltd。

1.3主要儀器

渦旋振蕩儀(QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，離心機(Centrifuge 5415D，Eppendorf)，分光光度計(NANODROP 2000，Therno scientific)，熒光定量PCR儀(ABI7500，Applied Biosystems)。

1.4分組

將大鼠隨機分為假手術組、模型組、美托洛爾組、連夏配方顆粒189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg組，每組15只。

1.5模型建立

動物模型參照文獻[7]制備。用3.5 %水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于大鼠板上。在大鼠左側第4、5肋間切口，打開胸腔，撕開心包，輕壓胸廓擠出心臟，用0號手術線于肺動脈圓錐與左心耳下2 mm處結扎冠狀動脈左前降支，立即將心臟放回胸腔，關閉切口，縫合皮膚，局部應用青霉素8萬單位以防止感染。假手術組大鼠只穿線不結扎。

1.6給藥

假手術組、模型組均給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，美托洛爾組給予美托洛爾100 mg/kg灌胃，連夏配方顆粒189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg組分別給予相應劑量連夏配方顆粒灌胃；建模當天即給藥；均每天1次，連續給藥30天；每天每只大鼠給予生理鹽水的量均為10 mL/kg。

1.7指標檢測和方法

連續灌胃給藥30天后，除假手術組外其余各組大鼠均于心肌梗死周圍區相同部位取心肌組織100 mg，假手術組大鼠于假手術操作處周圍區相同部位取心肌組織100 mg，保存于-80℃。用Real-time RT-PCR方法檢測心肌組織TH與AchE mRNA表達水平。引物序列見表1，實驗步驟參照試劑盒說明書及文獻[8-9]進行。

表1　引物序列

1.8統計學處理

2結果

2.1對心肌組織TH mRNA及表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死周圍區心肌組織TH mRNA明顯升高(P<0.05)。給藥30天后，與模型組比較，美托洛爾組大鼠TH mRNA明顯降低(P<0.05)；連夏配方顆粒189.00、94.50、47.25 mg/kg組大鼠TH mRNA均明顯降低(P<0.05)。與美托洛爾組比較，連夏配方顆粒189.00 mg/kg組大鼠TH mRNA明顯降低(P<0.05)。說明連夏配方顆粒可以改善心梗后大鼠心交感神經重構，上述差異均有統計學意義，見表2。

表2　連夏配方顆粒對心肌梗死大鼠心肌組織TH mRNA

注：與假手術組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較cP<0.05，dP<0.01；與美托洛爾組比較，eP<0.05，fP<0.01。

2.2對心肌組織AchE mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌梗死周圍區心肌組織AchE mRNA明顯升高(P<0.01)。給藥30天后，與模型組比較，美托洛爾組大鼠AchE mRNA變化不明顯(P>0.05)；連夏配方顆粒189.00、94.50、47.25 mg/kg組大鼠AchE mRNA均明顯降低(P<0.01)。與美托洛爾組比較，連夏配方顆粒189.00、94.50 mg/kg組大鼠AchE mRNA明顯降低(P<0.01)。說明連夏配方顆粒可以改善心梗后大鼠心迷走神經重構，上述差異均有統計學意義，見表2。

3討論

心臟自主神經包括交感神經和迷走神經，在對心臟獨立的局部調節作用中，兩者相反相成，共同協調完成對心臟節律、傳導和收縮力等的直接調控。同時，體內各種機制還可以通過心臟自主神經對心臟發揮調節作用。

心臟自主神經對于心肌缺血缺氧損傷十分敏感。心肌梗死發生后，相同及周圍區域的心臟自主神經亦發生損傷或壞死，且在形態和功能學都發生了不均一性重構，集中表現為梗死區心肌自主神經去支配狀態與梗死周圍區心肌自主神經高支配狀態。而由此引發心電生理及復極離散系列性繼發性紊亂，進而容易在人體發生致命性心律失常(如室速、室顫等)，且成為心梗后發生室速和心臟性猝死的關鍵性因素[2-4，10]。

TH位于去甲腎上腺素能神經纖維內，是去甲腎上腺素合成的限速酶，參與全部兒茶酚胺代謝的限速環節，且具有高度地特異性，因此常作為交感神經標志物，用于標記交感神經，檢測交感神經分布情況[11-12]。AchE在心肌梗死后不同部位心肌中具有不同的活性，其不僅是評價迷走神經活性的指標，也是評價迷走神經分布支配的指標[13-16]。故二者常被分別用于標記心交感神經與迷走神經以探討心梗后心律失常與神經重構的相關機制。

本實驗結果表明，心肌梗死后，在心梗周圍區心臟交感神經與迷走神經均發生了再生重構現象，形成了自主神經高支配狀態；而中藥小復方連夏配方顆粒可以顯著降低心肌梗死后大鼠心梗周圍區TH mRNA與AchE mRNA的表達水平，從而改善心肌梗死后大鼠心梗周圍區交感神經與迷走神經的再生重構，但其具體作用機制尚需進一步研究。

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(本文編輯：董歷華)