芪衛顆粒對糖尿病腎病大鼠足細胞nephrin表達影響的實驗研究

·論著·

作者單位：100069北京,首都醫科大學中醫藥學院[王馨瑤(碩士研究生)、耿建國、高彥彬、李嬌陽(碩士研究生)、周盛楠(碩士研究生)、鄒大威、劉迎新(碩士研究生)];中醫絡病研究北京市重點實驗室[王馨瑤(碩士研究生)、耿建國、高彥彬]

芪衛顆粒對糖尿病腎病大鼠足細胞nephrin表達影響的實驗研究

王馨瑤耿建國高彥彬李嬌陽周盛楠鄒大威劉迎新

【摘要】目的探討芪衛顆粒對糖尿病腎病大鼠腎組織足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin表達的影響。方法隨機選取10只健康雄性SD大鼠為正常組，其余30只采用腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素(60 mg/kg)誘導糖尿病大鼠模型，將成模大鼠隨機分為模型組、西藥組以及芪衛顆粒組，將西藥組按纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃、芪衛顆粒組按生藥10 g/(kg·d)灌胃，連續給藥。于給藥第24周檢測大鼠血肌酐、血尿素氮及內生肌酐清除率；24周后將大鼠處死，采用PAS染色法將腎組織染色，在光鏡下觀察大鼠腎組織病理改變；采用western blot法檢測腎組織足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin表達情況。結果與正常組相比，模型組大鼠血肌酐、血尿素氮水平顯著升高，內生肌酐清除率及足細胞nephrin表達水平顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組大鼠血肌酐、血尿素氮水平明顯下降，內生肌酐清除率及nephrin表達水平明顯上調(P<0.05)。結論芪衛顆粒能夠上調糖尿病腎病大鼠腎組織足細胞nephrin的表達，減輕足細胞損傷，保護腎功能，延緩糖尿病腎病的發生發展。

【關鍵詞】芪衛顆粒；糖尿病腎病；足細胞；nephrin

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2012CB518602);國家自然科學基金面上項目(81173238)

作者簡介:王馨瑤(1989- )，女，2012級在讀碩士研究生。研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥。E-mail：wangxinyao0421@aliyun.com

通訊作者：耿建國(1956- )，博士，教授，主任醫師，碩士研究生導師。研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥。E-mail：gengdoctor@sina.com.cn

【中圖分類號】R285.5

收稿日期：(2014-10-20)

Influence ofQiweiGranules on the expression of nephrin in podocyte of rats with diabetic nephropathyWANGXin-yao，GENGJian-guo，GAOYan-bin，etal.CapitalMedicalUniversitySchooloftraditionalChineseMedicine,Beijing100069,China

Correspondingauthor:GENGJian-guo，E-mail:gengdoctor@sina.com.cn

Abstract【】ObjectiveThe study aims to investigate the effects of Qiwei Granules on the expression of nephrin in podocytes of rats with diabetic nephropathy (DN). Methods10 normal male SD rats were chosen randomlyas the normal group, and the other 30 rats were abdominally administered with a single injection of streptozotocin (60mg/kg) to induce DN rat models. The model rats were divided into 3 groups randomly: the model group, the western medicine group and Qiwei Granules group, Qiwei Granules group was given the prescription of Qiwei of 10 g /( kg·d), Western medicine group was given valsartan of 10 mg/( kg·d) for 24 weeks．The changes in blood urea nitrogen, serum creatinine and urinary were observed in the 24th week. After 24 weeks, all the rats were sacrificed. The pathological change of renal tissue was detected by PAS. And the expression of nephrin in podocyte was observed by western blot. ResultsCompared with normal control group, the renal function and the expression of nephrin in model groupwere significantly decreased (P<0.05). Compared with model group, the renal function and the expression of nephrin in other groups were significantly increased (P<0.05). ConclusionThe taking of Qiwei Granules could up-regulate the expression of nephrin in podocyte, decrease the damage of podocyte, and improve the renal function, which may slow the progression of DN.

【Key words】QiweiGranules;Diabetic nephropathy;Podocyte;Nephrin

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)多在糖尿病發病后5～10年發生，是導致終末期腎病發生的最主要病因。既往對DN發病機制的研究主要集中在細胞外基質的堆積、腎小球基底膜的增厚、腎間質纖維化及腎小球硬化等[1]。近年來研究發現，足細胞損傷是本病發生的中心環節[2-3]，尤以足細胞中裂孔隔膜蛋白損傷最為重要。nephrin是現今公認最重要的裂孔隔膜蛋白，當其表達異常時，足細胞結構和功能則發生異常改變，導致腎小球濾過功能減退，腎功能下降，促進DN的發生、發展[4-5]。因此，調節裂孔隔膜蛋白nephrin表達，保護足細胞，是延緩本病發生、發展的重要環節。本實驗通過觀察芪衛顆粒對DN大鼠腎組織足細胞nephrin表達的影響，探討其對DN大鼠腎組織足細胞的保護作用，現將研究結果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2試劑及藥物

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma，批號：S1030)檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，0.1M，pH:4.4，批號：32J00101)。芪衛顆粒(主要成分：黃芪12 g、生地10 g、衛矛10 g、大黃6 g，由首都醫科大學中藥制劑室制備)。纈沙坦膠囊(北京諾華制藥有限公司，批號：X1440)。Rat nephrin(Sigma,PRS2265-100UG)。

1.3主要儀器

酶標儀(北京市新風機電技術公司，ZS-3)；離心機(Sigma，3K18)；電泳儀(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，DG-300C)；迷你雙垂直電泳槽(北京市六一儀器廠，DYCZ-24DN)；迷你轉印電泳槽(北京市六一儀器廠，DYCZ-40D)；水平搖床(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，TDK-2)；超聲細胞粉碎機(上海新芝生物技術研究所，JY92-II)；臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司，TGL-20M)。

1.4模型建立和分組給藥

將40只大鼠適應性喂養1周后，依據隨機數字表法分為2組：一組10只為正常組；另一組30只為造模組。造模組采用腹腔注射大劑量STZ(60 mg/kg)方法造模，三天后檢測空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功。造模成功后，隨機分為三組，將西藥組按纈沙坦10 mg/(kg·d)灌胃、芪衛顆粒組按生藥10 g/(kg·d)灌胃；正常組及模型組予等量蒸餾水灌胃。實驗期間自由飲食，連續給藥24周。

1.5標本采集和檢測方法

于實驗第24周將大鼠斷尾取血2 mL，靜置20分鐘左右，離心2000～3000 r/min，20分鐘，分離血清進行血尿素氮、血肌酐的檢測，并按照公式計算內生肌酐清除率，即內生肌酐清除率=尿肌酐×總尿量(mL/24h)/血肌酐/1440(min)/BW(g)×100，單位為mL/(min·BW/100)。于實驗第24周末取材，取出腎臟去除包膜及周圍結締組織，常規制片，PAS染色法染色。用western blot檢測nephrin表達情況，檢測結果以β-actin作為內參，使用Quantity One軟件分析；PAS染色結果在400倍鏡下進行觀察。

1.6統計學方法

2實驗結果

2.1各組大鼠血肌酐、血尿素氮及內生肌酐清除率的比較

于給藥第24周測定大鼠血肌酐、血尿素氮及內生肌酐清除率。與正常組相比，模型組及各給藥組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯上升，內生肌酐清除率顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組大鼠血肌酐、血尿素氮明顯下降，內生肌酐清除率顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，各給藥組無統計學差異(P>0.05)，詳見表1。提示芪衛顆粒能夠顯著改善DN大鼠腎功能。

2.2各組大鼠腎組織足細胞nephrin表達比較

于實驗第24周使用western blot檢測結果如下，與正常組相比，模型組大鼠足細胞nephrin表達顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，各給藥組大鼠足細胞nephrin表達顯著升高(P<0.05)，各給藥組無統計學差異(P>0.05)，詳見圖1。提示芪衛顆粒可上調腎組織足細胞nephrin表達。

表1　給藥24周后各組大鼠血肌酐、血尿素氮及

注：與正常組相比差異有統計學意義,aP<0.05；與模型組相比差異有統計學意義,bP<0.05

圖1　給藥24周各組大鼠足細胞nephrin蛋白表達 (western blot)

2.3腎組織PAS染色

光鏡下可見，正常組大鼠腎組織結構無明顯異常，腎小球基底膜無異常增厚；模型組大鼠腎組織系膜增生明顯，細胞外基質顯著增多，部分腎小球出現結節樣硬化，PAS染色面積較兩給藥組增加；兩給藥組PAS染色面積較模型組明顯減少，病變較模型組減輕。詳見圖2。

A正常組　B模型組　C西藥組　D芪衛顆粒組

3討論

近年對于DN發病機制的研究表明[6-7]：足細胞的裂孔隔膜是腎小球濾過屏障的最后一道防線，而高糖狀態可直接導致足細胞損傷；當足細胞及其裂孔隔膜蛋白受到損傷時則導致蛋白尿的出現，最終導致腎小球硬化癥。nephrin是第一個被發現的足細胞裂孔隔膜蛋白，也是最重要的裂孔隔膜蛋白，具有維持腎小球濾過屏障結構及功能完整性的作用[8-9]。有研究表明[10-11]：nephrin是腎小球損傷的早期指標，其表達減少直接導致了腎小球濾過功能喪失及腎功能異常。近年來國內外相關臨床研究發現[12-13]：nephrin蛋白異常表達不僅與先天性腎病有關，還與多種繼發性腎病相關，當nephrin表達異常時，可引起腎功能異常及大量蛋白尿的發生。因此，調節nephrin表達，減輕足細胞損傷，就成為防治DN的重要環節。

中醫認為糖尿病腎病主要病機為氣陰兩虛，腎絡瘀阻[14-15]；治療則采用益氣養陰，活血祛瘀通絡之法。芪衛顆粒是高彥彬教授根據多年臨床經驗擬定的方劑，方中黃芪、生地益氣養陰，扶助正氣；衛矛、大黃活血通絡，蠲除邪氣，上藥共奏益氣養陰、活血祛瘀通絡之效。前期實驗研究和臨床研究證實：本方具有調節轉化生長因子β/Smads信號通路、降低尿蛋白，顯著改善患者腎功能的作用[16-19]。

本實驗研究結果也表明：芪衛顆粒能夠降低大鼠血肌酐、血尿素氮，升高內生肌酐清除率，上調nephrin表達，減輕足細胞損傷，改善腎臟功能。其作用機制可能是通過上調足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin的表達，減輕DN大鼠足細胞損傷，保護腎組織，從而延緩DN的發生、發展。其詳細的作用機理有待進一步研究。

參考文獻

[1]李娜，孫匯，王拓，等.糖尿病腎病發病機制研究進展[J].北華大學學報，2012,2,13(1):68-72.

[2]劉志紅.足細胞是腎小球損傷的中心環節[N].健康報,2012-10-17(8).

[3]戴厚永，范亞平.足細胞損傷與糖尿病腎病關系的研究進展[J].醫學綜述，2013,9,19(17):3173-3175.

[4]Chen J,Gui D,Chen Y,et al.Astragaloside IV improves high glucose-induced podocyte adhesion dysfunction via pha3beta1 integrin upregulation and integrin-linked kinase inhibition[J].Biochem Pharmacol,2008,76(6):796-804.

[5]Peter V. Hauser, Federica Collino, Benedetta Bussolati,et al. nephrin and endothelial injury[J]. Current opinion in nephrology and hypertension,2009,18(1):3-8.

[6]SJ Shankland. The podocyte’s response to injury: Role in proteinuriaand glomerulosclerosis[J]. Kidney International ,2006,69(12): 2131-2147.

[7]Michael W. Steffes, Derek Schmidt, Rebecca Mccrery,et al.Glomerular cell number in normal subjects and in type 1diabetic patients[J]. Kidney International,2001,59(6) :2104-2113.

[8]匡蕾,葉山東.nephrin與糖尿病腎病的關系[J].國際病理科學與臨床雜志,2011,4,31(2):140-144.

[9]William M. Deen. What determines glomerular capillary permeability[J].commentaries,2004,10(114):1412-1414.

[10]Petri Aaltonen, Pauliina Luimula, Eva Astrom,et al.Changes in the Expression of nephrin Gene and Protein in Experimental Diabetic Nephropathy[J]. Laboratory Investigation,2001, 81(9):1185-1190.

[11]柳迎昭,吳晨光,宋麗敏,等. 糖尿病大鼠腎臟nephrin表達的動態觀察[J].臨床與實驗病理學雜志,2010,26(6):733-737.

[12]Harry Holthofer, Heikki Ahola, Marja-Liisa Solin,et al. nephrin Localizes at the Podocyte Filtration SlitArea and Is Characteristically Spliced in theHuman Kidney[J].American Journal of Pathology,1999, 155(5): 1681-1687.

[13]高旭光,任現國,張沛.裂孔膜蛋白nephrin和podocin與后天獲得性腎臟疾病關系研究進展[J].新進展,2011,14(14):1617-1619.

[14]李俊美.呂仁和教授治療糖尿病腎病的經驗[J].四川中醫.2009,27(5):1-3.

[15]趙迪.高彥彬教授治療糖尿病腎病學術思想和經驗[J].中醫研究,2007,20(1):42-44.

[16]艾志敏.芪衛顆粒干預糖尿病腎病臨床和部分作用機制研究[D].北京：北京中醫藥大學,2013.

[17]李敏州,高彥彬,馬鳴飛,等.芪衛顆粒對KK-Ay小鼠腎組織TGF-β_1/Smads信號轉導通路的影響[J].中醫雜志,2013,54(13):1141-1144.

[18]周靜鑫. 芪衛顆粒干預糖尿病腎病臨床療效及其保護足細胞作用機制研究[D].北京：北京中醫藥大學,2014.

[19]李步滿,高彥彬,吳麗麗,等.中藥芪衛顆粒對2型糖尿病大鼠腎臟氧化應激及病理改變的影響[J].中國中西醫結合腎病雜志,2011,12(1):20-23.

(本文編輯：蒲曉田)