人內(nèi)脂素的原核表達(dá)和分離純化

鐘佳蒨，張 濤

1成都外國語學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

人內(nèi)脂素的原核表達(dá)和分離純化

鐘佳蒨1，張 濤2

1成都外國語學(xué)校；2成都醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系

目的：構(gòu)建Visfatin原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組人內(nèi)脂素（Visfatin）。方法：從人LO2細(xì)胞中提取總RNA后，經(jīng)RT-PCR法得到人Visfatin的cDNA序列，用以構(gòu)建帶HIS標(biāo)簽的Visfatin重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，用Ni柱親和層析純化融合蛋白。結(jié)果：PCR擴(kuò)增出的目的基因片段為1600 bp左右，與理論大小一致。SDS-PAGE、Western blot、質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)證明了蛋白是Visfatin融合蛋白。結(jié)論：成功的表達(dá)并純化得到帶HIS標(biāo)簽的Visfatin融合蛋白。

內(nèi)脂素；原核表達(dá)；蛋白純化

1 引言

隨著生活水平的提升，肥胖的人和糖尿病患者也越來越多。在肥胖方面的快速研究已經(jīng)證實，脂肪組織分泌著各種高度活躍的蛋白質(zhì)，其中一種就是Visfatin（內(nèi)脂素）。Visfatin是一種原本被認(rèn)定為前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子（PBEF），由淋巴細(xì)胞分泌的，可以作為具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子。Visfatin已被報道高表達(dá)于骨髓、肝臟和肌肉組織中[1]，其次是腦、腎、脾、肺、睪丸、但在一些肥胖的動物模型中內(nèi)臟脂肪比皮下脂肪相對表達(dá)量更高。在懷孕期間胎膜也有分布[2]。這種激素在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都被發(fā)現(xiàn)[3]。在人類基因組中位于第七號染色體長臂7q22.1到7q31.33[4]之間。

此外，它還是一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Nampt），是一種涉及NAD+補(bǔ)救途徑中的一種酶。NAD+通過催化靶蛋白上乙酰化的賴氨酸殘基去乙酰化形成ADP-核糖[5]。這些沉默調(diào)節(jié)蛋白（Sir2）和人類同源基因消耗NAD+增加合成煙酰胺并通過從它們的靶蛋白的賴氨酸殘基上水解去除乙酰基生成一種新的代謝物乙酰ADP-核糖[6]。可以說Nampt）間接有助于細(xì)胞的長壽。

中國是一個糖尿病高發(fā)的國家，1995年統(tǒng)計為1600萬人，預(yù)計2025年會達(dá)到3760萬人[7]。和胰島素相比發(fā)現(xiàn)Visfatin/PBEF/ Nampt與IR（胰島素受體）的結(jié)合親和力是相似的[8]。許多研究證實，糖尿病患者Visfatin水平升高。Chen等研究發(fā)現(xiàn)[9],2型糖尿病患者的血漿Visfatin明顯高于非糖尿病人群,相關(guān)分析表明,Visfa?tin水平是2型糖尿病的獨(dú)立相關(guān)因素,推測Visfatin可能在2型糖尿病的發(fā)病過程中起到了一定的作用。

由于Visfatin和多種常見疾病相關(guān)，因此重組克隆人Visfatin并表達(dá)純化出蛋白，以便進(jìn)行相關(guān)的后續(xù)研究，具有一定的實用價值和科研研究意義。

2 材料與方法

2.1材料

E.coil DH5α菌株、E.coli BL21-DE3菌株來自實驗室保存，質(zhì)粒pET-32a-tev來自實驗室保存,Visfatin基因模板購買自武漢華美生物技術(shù)公司，Nco I和Xho I酶購買自Fermentas，T4DNA聚合酶購買自TaKaRa,DNA純化回收試劑盒購買自TIANGEN，質(zhì)粒小抽提取試劑盒購買自道普生物科技有限公司。

2.2方法

2.2.1目的基因的獲取

用Trizol從LO2細(xì)胞中提取RNA時，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行RT-RCR，過得CDNA文庫，以CDNA文庫為模板，設(shè)計引物，上游引物序列為CCATGG-GCCCACCCAACACAAGCAA,下游引物序列為CTCGAG-AATGATGTGCTGCTTCCAG（傾斜字體表示NcoI與XhoI的酶切位點(diǎn)），進(jìn)行PCR，94℃30s，52℃30s，72℃2min，30個循環(huán)。

2.2.2載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶NcoI與XhoI分別酶切載體pET-32a-tev以及PCR產(chǎn)物，37℃酶切3h，將酶切后的質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收。將回收后的載體與PCR產(chǎn)物按1:3比例混合[7]，室溫放置10min,轉(zhuǎn)化DH5α，涂含有氨芐青霉素的平板，挑取單克隆提質(zhì)粒，送公司（華大基因）測序。

2.2.3重組蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的，測序正確的重組載體轉(zhuǎn)化BL21-DE3，涂含有氨芐青霉素的平板，隨后挑取單克隆接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃,220rpm培養(yǎng)至OD600值為1.0左右時，加入IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，終濃度0.5mmol/L)，18℃誘導(dǎo)過夜，8000rpm離心15min收菌。

將收集的菌體用緩沖液A（20mM Tris-HCl,pH8.0+100 mM Na?Cl+10mM咪唑）重懸，用高壓均質(zhì)機(jī)（AVESTIN,）15000psi破四遍，4℃條件下20000rpm離心30min。離心后上清與沉淀經(jīng)SDSPAGE檢測，蛋白以可溶形式存在。收集上清，過膜（0.22μm），表達(dá)載體pET-32a-tev，帶有組氨酸標(biāo)簽，表達(dá)的目的蛋白前端含有TEV的酶切位點(diǎn)。過膜后上清，用蛋白純化儀（AKTA explorer100, GE Healthcare）過親和層析柱（HisTrap HP 5ml,GE Healthcare），用緩沖液B（20mM Tris-HCl+pH8.0+100mM NaCl+500mM咪唑）梯度洗脫。采用SDS-PAGE以及Western-blot對純化蛋白進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果分析

3.1目的基因PCR擴(kuò)增及重組載體鑒定結(jié)果

通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示Visfatin基因片段為1700 bp左右，與理論DNA表達(dá)片段大小一致（圖1）。將擴(kuò)增得到的Visfatin基因片段pET-32a-tev質(zhì)粒分別經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接后得到的重組質(zhì)粒再次雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在1600 bp處存在特異性片段（圖2）,構(gòu)建好的質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI登陸序列一致。

圖1 Visfatin的PCR片段的瓊脂糖電泳Fig.1 The Results of PCR

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切驗證

3.2蛋白純化結(jié)果

用蛋白純化儀過親和層析柱，高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為100mM-200mM之間時出峰，12%SDS-PAGE電泳驗證，可以獲得純度較高的重組VISFATIN蛋白（見圖3），在70KD處有明顯的單一目的條帶，經(jīng)親和層析純化后，每升菌液可以獲得大約30mg的重組VISFATIN蛋白，將純化后的重組蛋白透析后，用TEV酶切，再次經(jīng)過親和層析出去His標(biāo)簽，得到純度較高的重組蛋白（圖2）。

3.3重組蛋白的質(zhì)譜鑒定

經(jīng)純化的pET32a-Visfatin蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分離后,用考馬斯亮藍(lán)染色，切下69 kD蛋白帶，通過膠內(nèi)酶切后，對酶解產(chǎn)物進(jìn)行ESI-TOF-MS質(zhì)譜分析，結(jié)果通過http：//www.matrixscience. com網(wǎng)站的MASCOT數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定結(jié)果見圖3-9。質(zhì)譜結(jié)果表明，69 kD電泳蛋白帶為pET32a-Visfatin重組蛋白。

圖4 質(zhì)譜鑒定

3.4 Western blotting驗證

純化后pET32a-Visfatin重組蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE分析后進(jìn)行蛋白印跡鑒定，可見在相對分子質(zhì)量70 kD左右處出現(xiàn)特異性雜交帶，表明為Visfatin蛋白（圖3-10）。

圖5 pET32a-Visfatin免疫印記

4.討論

本文通過對VISFATIN原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化的研究表明：PCR擴(kuò)增出的Visfatin基因片段(1600 bp)與理論大小一致。測序結(jié)果證明pET-32a-tev-Visfatin重組表達(dá)質(zhì)粒無缺失和突變。SDS-PAGE和Western blot分析經(jīng)純化后的His-tev-Visfa?tin融合蛋白分子量約為70KD，其中His標(biāo)簽序列為17KD左右，Visfatin分子量約為53KD，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的結(jié)果相符。Histev-VISFATIN重組融合蛋白經(jīng)過親合層析后可以達(dá)到電泳純，同時能夠保證較高的產(chǎn)量。

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